1-32-1)عناصر ماکرو. 42

1-32-2)عناصر میکرو. 42

1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت… 42

1-32-4)ویتامین ها  43

1-32-5) Pluronic acid. 43

1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت… 44

مواد و روش ها 46

2-1)دستگاه های مورد نیاز. 47

2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده 47

2-3)لیست کامل مواد استفاده شده 48

2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده 50

2-5) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG44. 50

2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی.. 51

2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC.. 51

2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت… 51

2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG44. 52

2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44. 52

2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44. 53

2-8-1)انكوباتور دی اكسید كربن.. 53

2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 53

2-8-3) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44. 54

2-9) استریلیزاسیون انکوباتور. 54

2-10)  آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها 55

2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک… 55

2-11) کشت سلول های rCHO DG44. 56

این مطلب را هم بخوانید :

2-12)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH.. 56

2-13) شمارش سلول های rCHO DG44. 57

2-13-1)اصول شمارش سلول. 57

2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability)) 59

2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها  Cell Freezing)) 59

2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG44. 60

2-14-1)پلاسمید حاوی ژن. 60

2-14-2)تهیه DNA‌ 60

2-14-3)کشت سلول. 61

2-15)بهینه سازی فرایند TGE. 61

2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI 61

2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 61

2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE. 62

2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن.. 62

2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری.. 62

2-16)افزودن  غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت… 62

2-16-1) تعیین پروفایل رشد. 70

2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش  Elisa. 70

2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها 72

نتایج.. 76

3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE. 76

3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE. 76

3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE. 83

3-1-3)بررسی میزان بهینه  DNAجهت انجام TGE. 96

3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت  ProCHO 5,CD DG44و BRC.. 109

3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت… 110

3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA.. 115

3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5. 115

3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44. 117

3-4-3)  بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD.. 118

3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب… 119

3-6)بررسی تاثیر  استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE. 121

بحث و نتیجه گیری نهایی.. 129

منابع. 133

اختصارات… 136

Optimization of recombinant protein production in TGE system… 137

Abstract 137

چکیده

بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.

فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، یک پپتید طبیعی است که با اتصال به فیبرین موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فیبرین، فیبرینوژن و سایر پروتئین‌های انعقادی شده و  با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسیب بافتی و در نهایت نجات بیمار می‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.

بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell  DNA106/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell  106/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده 105×5 سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA)در سلول CHO  در این فرایند از 6 پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین  می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.

واژه های کلیدی: سلول CHO , t-PA , فیبرینولیز  ,فیبرینوژن

مقدمه

1-1)اهمیت پروئینهای نوترکیب – جایگاه جهانی و درمانی

پروتئین ها ماکرومولکولهایی هستند که در هرجایی از سلولها جای می گیرند.آنها در رشد سلولی، متابولیسم، سازماندهی، انتقال و جهش نقش دارند. در ارگانیسم های چندسلولی، پروتئین ها سیستم ایمنی، سیگنال بندی عصب، رشد و تقسیم کل ارگانیسم را کنترل می کنند.جهش یا رونویسی غیرعادی پروتئین ها می تواند منشاء بیماریهای بسیاری شود. با توجه به اینکه ژنوم انسان حاوی بیش از 30.000 ژن است و اینکه تعداد پروتئین هایی که تولید می شوند حتی بیشتر از این مقدار هستند،فرصت هایی برای شرکت های داروسازی به دست آمده تا داروهای جدیدی را توسعه دهند که بسیار فراوان هستند. بنابراین در طول دهه های گذشته،پروتئین ها به اهدافی برای توسعه درمانهای جدید تبدیل شدند. وقتی که پروتئین ها اولین بار به عنوان موارد درمانی مورد استفاده قرار گرفتند، از منابع انسانی و حیوانی خالص سازی شدند. نمونه هایی از این قبیل شامل هورمون رشد انسان از جسد انسان، انسولین از گاو یا خوک و هورمون تحریک کننده غدد ترشحی انسان از اوره می شدند. به هر حال استفاده از این منابع با نگرانی هایی هم همراه بود.خوشبختانه امروزه محصولات منابع حیوانی کمتر به کار می روند. در واقع از اواخر دهه 1970، رشد در بیوتکنولوژی امکان تولید پروتئین از “DNA دارای صفات ارثی” با استفاده از سیستم های میزبان پروکاریوتی یا یوکاریوتی را فراهم کرده است.این پروتئین ها ، دارای صفات ارثی هستند و از پروتئین های داخلی قابل تمایز هستند، آنها بواسطه رونویسی ژنهایی که دارای صفات ارثی جدید هستند، تولید می شوند. اولین پروتئین  نوترکیب، که برای انسان به کار رفت انسولین بود که در E.coli توسط Eli Lili در سال 1984 تولید شد. اولین پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان یوکاریوتی ، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی t-PA از سلولهای تخمدان هامستر چینی CHO2 بود که در سال 1986 تولید شد. در سال 2007، بیش از 170 محصول بیودارویی وجود داشت که توسط انجمن دارو و غذا FDA