2-1- مشخصات گیاهشناسی برنج……………………………………….. 7

2-2- وضعیت ژنتیکی برنج…………………………………………………… 7

2-3- مهندسی تولید متابولیت­های ثانویه درگیاهان………………………. 8

2-4- ژن­های مسئول بیوسنتز فلاوونوئیدها و آنتوسیانین­ها……………….. 9

2-5- برنج رنگی……………………………………………………………… 11

2-6- نشانگرها در برنامه­ های اصلاحی………………………………….. 12

2-6-1- تعریف نشانگر………………………………………………………. 12

2-6-2- انواع نشانگرها…………………………………………………….. 13

2-6-2-1- نشانگرهای موفولوژیکی…………………………………………13

2-6-2-2- نشانگرهای سیتوژنتیکی………………………………………. 13

2-6-2-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………… 14

2-6-2-4- نشانگرهای مولکولی…………………………………………… 14

2-6-2-4-1- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA……………………….

2-6-2-4-1-1- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر هیبریداسیون…………… 15

2-6-2-4-1-2- نشانگر­های مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیره­ای پلیمراز..16

2-6-2-4-1-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR و هیبریداسیون….. 16

2-6-2-4-1-4- نشانگرهای مبتنی بر توالی­یابی (SNPها) و تراشه DNA….

2-7- کاربرد نشانگرهای مولکولی………………………………………. 17

2-8- انتخاب میان انواع مختلف نشانگرها…………………………….. 19

2-9- کاربرد نشانگرهای مولکولی در برنج……………………………… 19

2-10- انتخاب به کمک نشانگرها……………………………………….. 21

2-11- استفاده از نشانگرهای مولکولی درتهیه نقشه ژنتیکی……… 21

2- 12- ریزماهواره…………………………………………………………. 22

2-12-1- تشخیص آلل­های ریزماهواره……………………………………. 24

2-12-2- مزایای نشانگرهای ریزماهواره………………………………… 24

2-12-3- مشکلات کار با ریزماهواره…………………………………….. 25

2-12-3-1- اشتباهات آلل خوانی……………………………………….. 25

2-12-3-2- آلل­های صفر……………………………………………………. 26

2-12-3-3- اندازه نمونه مورد نیاز………………………………………… 26

2-12-4- ریزماهواره­ها درگیاهان و برنج………………………………….. 27

2-12-5- کاربردهای ریزماهواره…………………………………………… 28

2-13- نقشه­ های پیوستگی ژنتیکی…………………………………… 28

2-14- ویژگی­های نقشه…………………………………………………….. 29

2-15- سابقه نقشه یابی صفت رنگ دربرنج…………………………… 30

2-15-1- ارتباط بین رنگ پریکارپ وصفت گلوتیوز ………………………..33

2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات دیگر……………….. 33

2-15-3- روابط بین رنگ کلاله با صفات دیگر…………………………….. 34

2-15-4- ارتباطات بین رنگ پوشبرگ و صفات دیگر…………………….. 34

2-15-5- ارتباط بین رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ…………………………. 35

2-15-6- ارتباط بین رنگ زبانک با صفات دیگر………………………….. 35

2-15-7- ارتباطات بین رنگ زبانک و رنگ پریکارپ……………………… 35

2-15-8- نشاندار کردن ژن­های مهم اقتصادی و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)…36

2-15-9- مطالعه ژنتیکی و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج……… 37

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- مواد گیاهی…………………………………………………………. 41

3-1-1- رقم 18-33DN-……………………………………………………

3-1- 2- رقم ندا ……………………………………………………………42

3-2- کشت والدین و جمعیت F2…………………………………………

3-3- تهیه نمونه برگی…………………………………………………… 43

3-4- ارزیابی صفت……………………………………………………….. 44

3-5- استخراج DNA ………………………………………………………

3-5-1- روش استخراج DNA……………………………………………..

3-6- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده…………………… 49

3-6-1- ازطریق اسپکتروفتومتر…………………………………………. 49

3-6-2- به وسیله الکتروفورز ژل آگارز…………………………………… 49

3-7- بارگذاری نمونه­ ها و اجرای الکتروفورز…………………………… 50

این مطلب را هم بخوانید :

3-8- آماده سازی آغازگرهای ریزماهواره……………………………… 51

3-9- انجام واکنش PCR………………………………………………….

3-10- تجزیه وتحلیل داده ها…………………………………………….. 54

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- ارزیابی فنوتیپی…………………………………………………… 57

4-2- ارزیابی مولکولی…………………………………………………… 58

4-2-1- غربال والدین……………………………………………………… 58

4-2-2- تحلیل لینکاژ ………………………………………………………60

4-3- ارزیابی نشانگر RM253 در ارقام دیگر برنج……………………… 64

فصل پنجم

پیشنهادات……………………………………………………………….. 68

منابع………………………………………………………………………..70

ضمائم

لیست پرایمرهای بکار رفته در پژوهش………………………………… 79

تهیه محلول­های مادری…………………………………………………… 81

ماتریس داده­های مولکولی و فنوتیپی…………………………………. 83

چکیده:

وجود رنگدانه­ های آنتوسیانین در برنج عامل اصلی تولید پایه ساقه ارغوانی رنگ محـسوب می­شود. رنگ پایه ساقه در برنج رابطه مستقیم و قوی با تشکیل دانه ­های رنگی در برنج دارد که در زیر پوسته آنها به دلیل تراکم متفاوت رنگیزه­های آنتوسیانین در لایه­های مختلف پریکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگ­های سرخ، ارغوانی و سیاه مشاهده می­شود. بمنظور درک درست از مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین که اطلاعات مفیدی را در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک برنج به همراه خواهد داشت، الگوی تفرق ژن رنگ پایه ساقه با استفاده از تعداد 123 تک بوته از جمعیتF2  حاصل از تلاقی 18-33 – DN و ندا مورد مطالعه قرار گرفت.  ارزیابی تک بوته­های  F2 بر اساس رنگ پایه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگی (ارغوانی) و تعداد 40 بوته بی­رنگ تولید شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ایجاد می­نماید. آماره c2 این نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکیک  3:1 اختلاف معنی داری را نشان نداد (95/0p < ). در نتیجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سیستم کنترل تک ژنی تبعیت می­نماید. مطالعات انجام شده با استفاده از 59 نشانگر مولکولی میکروساتلیت میزان 28 درصد چند شکلی بین والدین را نشان داد و آنالیز پیوستگی روی تک بوته­های مغلوب جمعیت F2 از تلاقی ندا × 18-33 –   DNثابت کرد که ژن رنگ پایه ساقه بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتی مورگان از ژن قرار دارد همبسته می باشد.

فصل اول: مقدمه

1-1- تولیدکنندگان برنج

برنج پس از گندم دومین غله مهم در دنیا به حسـاب می­آید و به عنوان یکی از مهمترین محصولات استراتژیک جهان از اهمیت و جایگاه ویژه­ای برخوردار است، نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای خاور دور می­باشد. بیش از نصف محصول برنج دنیا در دو کشور هند و چین تولید می­شود. به طور کلی، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه، تایلند، ویتنام، لائوس، اندونزی، فیلیپین، پاکستان، هند، آمریکا، ژاپن، ایتالیا، مصر، چین، برزیل، کوبا، مکزیک و استرالیا از تولیدکنندگان عمده برنج به شمار می­آیند. میزان تولید برنج در تایلند، برمه، ویتنام و لائوس بیش از مصرف داخلی آنهاست و بنابراین نزدیک به 90 درصد برنج موجود در بازارهای دنیا متعلق به این 4 کشور می­باشد (53).

2-1- کشت برنج در ایران

کشت برنج در ایران در نواحی شمالی و در نواحی جنوبی به ویژه خوزستان تاریخچه طولانی دارد. شواهد نشان می­دهد که این محصول در این ناحیه، قرنها پیش از میلاد مسیح و در زمان هخامنشیان رواج داشته است. در ایران اسلامی نیز علی رغم دستاوردهای خوب تحقیقاتی و قریب به 600 هکتار زیر کشت برنج، متاسفانه به دلیل استفاده ناصحیح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعیت ایران، تولید داخلی برنج پاسخگوی نیاز مردم نیست و مقادیر قابل توجهی از خارج وارد می­شود. افزایش تولید به دو روش افزیش سطح زیر کشـت و افزایش در واحد سطـح امـکان­پذیر می­باشد. بدلیل محدود بودن زمین­های زراعی و نیز کمبود شدید آب، بدون تردید باید تولید را در واحد سطح با استفاده از روش­های به­زراعی و به­نژادی افزایش داد. دستیابی به خودکفایی در تولید برنج و حفظ ثبات قیمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهای کم درآمدی است که برنج بعنوان تنها غذای اصلی، اساس تأمین نیازهای غذایی بوده و برای مردم فقیر و آسیب پذیر این کشورها شغل و درآمد ایجاد می­ نماید(53).

3-1- متابولیت­ های ثانویه در گیاهان

بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیبات موسوم به متابولیت­های ثانویه را تولید می­کند. در مفهوم کلی، متابولیت­های ثانویه ترکیبات آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است، به نظر می­رسد که متابولیت­های ثانویه به عنوان مواد طبیعی نقش اکولوژیکی مهمی در واکنش­های دفاعی گیاهان و همچنین گرده افشانی و انتشار دانه­های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضی از این ترکیبات به عنوان علف­کش و حشره کش در صنعت استفاده می­شوند در حالی که برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیبات دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام و كیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).

به دلیل كاربردهای فراوان، متابولیت­های ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق روش­های مولكولی و مهندسی ژنتیـك محسـوب می­شوند. مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یك موضوع جالب و مهم برای بسیاری از پروژه­های تحقیقاتی شده است و نقش تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است.

در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیت­های ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندك از مسیرهای تولید زیستی متابولیت­های ثانویه و برهم كنش آنزیم­های درگیر در این مسیر همچنین اطلاعات محدودی از ژن­های مربوط به متابولیت­های ثانویه در دسترس است. یكی از مسیرهایی كه مطالعات بیشتری در سطح ژن­های دست اندركار آن نسبت به دیگر متابولیت­های ثانویه انجام شده است، مسیـر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیـانین­ها است (20). اكثـر ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها همسانه­سازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، مولكولی و ژنتیك این دست از متابولیت­های