پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

بررسی اثر لیپو پلی ساکارید استخراج شده از سالمونلا انتریکا بر فعالیت COX-2، H2O2 وNO  در زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش

 

اساتید راهنما:

جناب آقای دکتر حمیدرضا احمدی آشتیانی

سرکار خانم دکتر ارکیده قربان دادرس

 

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر مهدی هدایتی

سرکار خانم دکتر فریناز راشد مرندی

 

سال تحصیلی 92-1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                  صفحه

خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………….. 1

فصل اول: كلیات

1-1. بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-2. ضروریت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………… 7

1-3. اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8

1-4. سئوالات و فرضیه‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 9

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………………………………………… 10

2-1-1. تاریخچه لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………. 12

2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………… 15

2-1-2-1. آنتی ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O)…………………………………………………………………………………. 17

2-1-2-2. الیگو ساکارید مرکزی………………………………………………………………………………………………………….. 17

2-1-2-3. لیپید A……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18

2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19

2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19

2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21

2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

2-6-1. تاریخچه‌ی هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

2-8. پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67

2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71

2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93

3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

3-11-2. منحنی استاندارد H2O2……………………………………………………………………………………………………….. 98

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110

3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده…………………………………………. 111

این مطلب را هم بخوانید :

3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 111

3-18-2. منحنی استاندارد H2O2…………………………………………………………………………………………………….. 111

3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112

3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده……………………………………….. 112

3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده………………………………………………………………………. 113

3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113

فصل چهارم: نتایج

4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116

4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT….. 117

4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)      118

4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   119

4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)       121

4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)     122

4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)     123

4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   124

4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)  125

4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)………….. 126

4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف……………………………………………….. 127

4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف…………………………………………….. 128

 

4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف………………………………………… 129

4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست……………………………………………………… 138

5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo…………………………………………………………… 142

5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro………………………………………………… 144

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 149

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 162

فهرست جداول

جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135

فهرست نمودارها

نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116

نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117

نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118

نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119

نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120

نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120

نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)       121

نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122

نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)     123

نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124

نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125

نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126

نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم       127

نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم     128

نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم  129

فهرست اشكال

شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14

شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15

شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16

شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19

شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28

شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31

شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33

شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول…………………………………………………………… 34

شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها……………………………………………………………………………………………… 36

شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40

شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE2………………………………………………………………………………………………….. 41

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42

شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47

شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48

شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50

شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52

شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57

شکل  2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58