پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))
گرایش: میکروبیولوژی
عنوان:
بررسی اثر لیپو پلی ساکارید استخراج شده از سالمونلا انتریکا بر فعالیت COX-2، H2O2 وNO در زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش
اساتید راهنما:
جناب آقای دکتر حمیدرضا احمدی آشتیانی
سرکار خانم دکتر ارکیده قربان دادرس
اساتید مشاور:
جناب آقای دکتر مهدی هدایتی
سرکار خانم دکتر فریناز راشد مرندی
سال تحصیلی 92-1391
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
خلاصه فارسی……………………………………………………………………………………………………….. 1
فصل اول: كلیات
1-1. بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 4
1-2. ضروریت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………… 7
1-3. اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………….. 8
1-4. سئوالات و فرضیه‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 9
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1. لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………………………………………… 10
2-1-1. تاریخچه لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………. 12
2-1-2. ساختار لیپو پلی ساکارید………………………………………………………………………………………………………… 15
2-1-2-1. آنتی ژن O (شاخه‌ی اختصاصی O)…………………………………………………………………………………. 17
2-1-2-2. الیگو ساکارید مرکزی………………………………………………………………………………………………………….. 17
2-1-2-3. لیپید A……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18
2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19
2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19
2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21
2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21
2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22
2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23
2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24
2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25
2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28
2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29
2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29
2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30
2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30
2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31
2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31
2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32
2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33
2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34
2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35
2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35
2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36
2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37
2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37
2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38
2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39
2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40
2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43
2-6-1. تاریخچه‌ی هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43
2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44
2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45
2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46
2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47
2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49
2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50
2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52
2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53
2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53
2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53
2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54
2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54
2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55
2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55
2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55
2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56
2-8. پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57
2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58
2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61
2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61
2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61
2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62
2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62
2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62
2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62
2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63
2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63
2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67
2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67
2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67
2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68
2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68
2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69
2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69
2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69
2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70
2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71
2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72
2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73
2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77
2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77
2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78
2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78
2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79
2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80
2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82
2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82
2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83
2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83
2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83
2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84
2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89
3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91
3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91
3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91
3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91
3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91
3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92
3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93
3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93
3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95
3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95
3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95
3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96
3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96
3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96
3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97
3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97
3-11-2. منحنی استاندارد H2O2……………………………………………………………………………………………………….. 98
3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98
3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98
3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99
3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99
3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99
3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100
3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101
3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101
3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101
3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103
3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103
3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104
3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105
3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107
3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109
3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110
3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110
3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110
3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده…………………………………………. 111
این مطلب را هم بخوانید :
3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 111
3-18-2. منحنی استاندارد H2O2…………………………………………………………………………………………………….. 111
3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112
3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده……………………………………….. 112
3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده………………………………………………………………………. 113
3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113
فصل چهارم: نتایج
4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116
4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT….. 117
4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 118
4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 119
4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 121
4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 122
4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 123
4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 124
4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 125
4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)………….. 126
4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف……………………………………………….. 127
4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف…………………………………………….. 128
4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف………………………………………… 129
4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست……………………………………………………… 138
5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo…………………………………………………………… 142
5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro………………………………………………… 144
منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 149
خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 162
فهرست جداول
جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135
فهرست نمودارها
نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116
نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117
نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118
نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119
نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120
نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120
نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 121
نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122
نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 123
نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124
نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125
نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126
نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 127
نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 128
نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 129
فهرست اشكال
شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14
شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15
شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16
شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19
شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28
شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31
شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33
شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول…………………………………………………………… 34
شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها……………………………………………………………………………………………… 36
شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40
شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE2………………………………………………………………………………………………….. 41
شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42
شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47
شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48
شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50
شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52
شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57
شکل 2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58
