4-1 گیاه بادرنجبویه……………………………………………………….8

1-4-1 مشخصات گیاهشناسی……………………………………….. 8

2-4-1 مشخصات دارویی……………………………………………….. 9

5-1گیاه سنبل الطیب………………………………………………….. 11

1-5-1 مشخصات گیاهشناسی……………………………………… 11

2-5-1 مشخصات دارویی………………………………………………. 12

6-1 نعناع فلفلی………………………………………………………. 13

1-6-1 مشخصات گیاهشناسی…………………………………….. 13

2-6-1 مشخصات دارویی……………………………………………… 14

7-1رنگیزه های گیاهی……………………………………………….. 15

8-1جوانه زنی……………………………………………………………18

1-8-1 عوامل درونی موثر بر جوانه زنی……………………………… 18

11-1اهداف مشخص تحقیق………………………………………… 21

12-1سؤالات تحقیق………………………………………………….. 21

13-1فرضیه ‏های تحقیق…………………………………………….. 22

14-1تعریف واژه‏ ها و اصطلاحات فنی و تخصصی…………………. 22

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده…………………………. 24

1-2پیشینه ی تحقیق………………………………………………….24

فصل سوم: مواد و روشها ……………………………………………..32

1-3شرح مطالعه………………………………………………………. 32

2-3 مواد و وسایل مورد استفاده در این پروژه ی تحقیقاتی……….33

2-3-1 ابزار……………………………………………………………… 33

2-2-3 مواد…………………………………………………………….. 34

1-2-3 توضیحی مختصر درمورد مواد و وسایل مورداستفاده………34

3-3 تهیه ی بذور……………………………………………………… 35

4-3 استریل کردن تمام ابزار و محیط کار…………………………… 35

5-3 تهیه ی مواد شیمیایی و مقادیر مورد نظر آنها……………….. 35

6-3 تهیه ی محلول ها……………………………………………….. 35

 

7-3 ضدعفونی و شستشوی بذور……………………………………37

8-3 ضدعفونی پتری دیش ها……………………………………….. 37

شکل 4-3پتری دیش های حاوی بذور و محلول……………………..38

9-3 کاشت بذور………………………………………………………. 38

10-3 آبیاری و جوانه زنی بذور ……………………………………….38

11-3 اجرای آزمایش در مرحله ی گیاهچه ای…………………….. 39

12-3 اندازه گیری طول ساقه چه و ریشه چه……………………….40

13-3 اندازه گیری رنگیزه های فتوسنتزی………………………….. 41

فصل چهارم: نتایج…………………………………………………… 43

1-4 نتایج بادرنجبویه…………………………………………………. 44

1-1-4جوانه زنی……………………………………………………… 44

2-1-4 طول ریشه چه………………………………………………… 45

3-1-4 طول ساقه چه…………………………………………………. 46

4-1-4 کلروفیل a………………………………………………………

5-1-4 کلروفیل b………………………………………………………

6-1-4 کاروتنوئیدها…………………………………………………… 49

2-4 نتایج نعناع فلفلی………………………………………………. 50

1-2-4 جوانه زنی…………………………………………………….. 51

2-2-4 طول ریشه چه………………………………………………… 51

3-2-4 طول ساقه چه………………………………………………… 52

4-2-4 کلروفیل a………………………………………………………

5-2-4 کلروفیل b……………………………………………………..

6-2-4 کاروتنوئیدها…………………………………………………… 55

3-4 نتایج سنبل الطیب………………………………………………. 57

1-3-4 جوانه زنی……………………………………………………… 57

2-3-4 طول ریشه چه………………………………………………… 58

3-3-4 طول ساقه چه…………………………………………………. 59

4-3-4 کلروفیل a……………………………………………………….

این مطلب را هم بخوانید :

5-3-4 کلروفیل b………………………………………………………

6-3-4 کاروتنوئیدها ……………………………………………………62

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………………………………………64

1-5 بحث………………………………………………………………. 64

2-5 نتایج بادرنجبویه…………………………………………………. 66

1-2-5 جوانه زنی…………………………………………………….. 66

2-2-5 طول ریشه چه………………………………………………… 67

3-2-5 طول ساقه چه………………………………………………… 68

4-2-5 کلروفیل a و b…………………………………………………..

5-2-5 کاروتنوئیدها……………………………………………………. 69

3-5 نتایج نعناع فلفلی……………………………………………….. 71

1-3-5 جوانه زنی……………………………………………………… 71

2-3-5 طول ریشه چه…………………………………………………. 71

3-3-5 طول ساقه چه…………………………………………………. 72

4-3-5 کلروفیل a و b………………………………………………….

5-3-5 کاروتنوئیدها……………………………………………………. 73

4-5 نتایج سنبل الطیب……………………………………………….. 75

1-4-5 جوانه زنی………………………………………………………. 75

2-4-5 طول ریشه چه…………………………………………………. 76

3-4-5 طول ساقه چه…………………………………………………. 76

4-4-5 کلروفیل a و b………………………………………………….

5-4-5 کاروتنوئیدها…………………………………………………… 77

5-5 نتیجه گیری………………………………………………………. 78

پیشنهادات…………………………………………………………….. 80

منابع……………………………………………………………………. أ‌

چکیده:

در عصر حاضر استفاده از نانوذرات به موضوعی در جهت پیشبرد اهداف انسان در امور مختلف از جمله: صنعتی، پزشکی، غذایی و … تبدیل شده است. استفاده از راهکارهای مختلف برای ورود نانوذرات به زندگی انسان باعث شده تا تحقیقات زیادی پیرامون آن انجام گیرد. لذا ما بر آن شدیم تا در مسیر پیش رو گامی در جهت موفقیت این طرح جهانی برداریم. به منظور بررسی تاثیر تیتانیوم دی اکسید و نانوذرات تیتانیوم دی اکسید بر جوانه زنی، رشد دانه رست ها و میزان رنگیزه های فتوسنتزی بادرنجبویه، سنبل الطیب، نعناع فلفلی در سال 1391 در دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان در قالب یك طرح كاملا تصادفی و به صورت فاكتوریل با 4 تکرار انجام شد که در آن فاکتورها را، دو متغیر مستقل: غلظت های مختلف تیتانیوم دی اکسید و نانوذرات تیتانیوم دی اکسید و متغیر وابسته: درصد جوانه زنی و میزان رنگیزه های فتوسنتزی، تشکیل می دادند. نتایج این تحقیق حاکی از آن بود که اثرات مختلف نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید و تیتانیوم دی اکسید بر جوانه زنی، رشد دانه رست ها و میزان رنگیزه های فتوسنتزی گیاهان سنبل الطیب، بادرنجبویه و نعناع فلفلی، نسبت به یکدیگر متفاوت بود. که این موضوع به نوع گیاه، شرایط کشت و…بستگی دارد. تیتانیوم دی اکسید و نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید امروزه در اکثر تحقیقات انجام گرفته بر روی گیاهان بخصوص، به کار می رود.

نتایج بدست آمده در تحقیق انجام شده برای بادرنجبویه نشان داد که تیتانیوم دی اکسید و نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید به جز کلروفیل a در بقیه ی موارد اثر معنی دار داشتند. تیتانیوم دی اکسید و نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید در مورد گیاه نعناع فلفلی بر طول ریشه چه، کلروفیلb و کاروتنوئیدها و همچنین برای گیاه سنبل الطیب بر روی طول ریشه چه، کلروفیل a وb و کاروتنوئیدها اثر معنی دار داشتند.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

از فناوریهای نوینی که اخیرا وارد عرصه ی گیاهی و به طبع آن کشاورزی شده است، استفاده از فناوری نانو می باشد. نانوتکنولوژی دستكاری یا مجتمع كردن اتمهای منفرد، مولكولها یا توده های مولكولی به ساختارهایی با ویژگیها و صفات جدید بسیار متفاوت است. این بین استفاده از نانو ذرات نقره و دی اكسید تیتانیوم گسترش زیادی پیدا نموده است.

2-1- نانوذرات

در سالهای اخیر کاربردهای نانوتکنولوژی در شاخه های علوم زیست شناسی و پزشکی مورد مطالعه قرار گرفته است. هدف استفاده از ذرات نانو رساندن مواد دارای ویژگیهای خاص برای درمان بیماریهای گیاهی است. اخیرا اندازه ی ذرات نانو به زیر100 نانومتر رسیده است که در رشته های علوم زیستی و پزشکی کاربرد داشته و کابردهای تجاری، اقتصادی و… آن کاملا مشهود است (میشرا و همکاران[1]، 2009 کوریدور و همکاران[2]، 2009).گیاهان عالی به شدت با اتمسفر و محیط زیست خود در تقابل هستند، مطالعه روی سمیت نانو مواد هنوز ضروری است و به نظر می رسد اثرات منفی روی رشد و نمو گیاهان داشته باشند(مونیکا و همکاران[3]، 2009). نانوبیوتکنولوژی از ترکیب دو علم بیوتکنولوژی و نانو بوجود آمده است. نانوذرات به صورت تجمعی از اتمها یا مولکولها با حداقل اندازه ی بین 1و100نانومتر می باشند(موهانراج و همکاران[4] ، 2006و مونیکا و همکاران، 2009). اینکه ذرات نانو را بتوان کاملا از مواد مختلف ساخت و اینکه آنها بتوانند فعالیتهای وابسته به ترکیبات شیمیایی و اندازه یا شکل ذرات را توضیح دهند، چندان ارزشمند نیست. گیاهان عالی، دارای اثرات متقابلی بین محیط  خاکی و اتمسفر خود می باشند و انتظار می رود که توسط ذرات نانو نتایج بیشتری از این اثرات بدست آید. مطالعه روی سمیت مواد نانو و به طور اساسی مدارکی دال بر اثرات منفی آنها روی رشد و نمو گیاهان هنوز ضروری است( مونیکا و همکاران، 2009).

ذرات نانو می تواند از مواد مختلف مثل پروتئینها، پلی ساکاریدها و پلیمرهای سنتز شده تهیه شوند. انتخاب این مواد وابسته به فاکتورهای زیر است:1)اندازه ی ذرات نانوی مورد نیاز2)برنامه های ذاتی داروها مثل حلالیت و ثبات آبی آنها3) ویژگیهای سطحی آنها مثل بار و نفوذپذیری4)درجه ی گرادیان زیستی، مطابقت زیستی و سمیت5) میل به آزاد شدن دارو و6) آنتی جنیسیتی[5] محصول پایانی.

ذرات نانو از 3طریق بدست می آید.1)انتشار پلی مرهای تشکیل شده2)پلی مریزاسیون مونومرها و3)انعقاد یونی یا توده سازی پلی مرهای هیدروفیل. اگرچه روشهای دیگری هم مثل تکنولوژی سیالات و انعکاس ذرات در قالبهای ضد آب(پرینت) هم به عنوان روشهایی برای تولید ذرات نانو به کار می رود(موهانراج و همکاران، 2006)

نانوذرات به صورت های مختلفی وجود دارند مثل آهن و آهن اکسیداز که به صورت فلزی می باشند. نانوذرات از مواد آهن دار و یا مواد فری مغناطیسی با اندازه ی کوچک (معمولا 10 تا20 نانومتر) بدست می آیند که می توانند نوع خاصی از مغناطیسم به نام سوپرمغناطیسم را ایجاد کنند. نانوذرات مغناطیسی Fe از لحاظ کاربردهای دیگر در زمینه ی ترکیبات الکتریکی اهمیت دارند(مثل ترنسفرمرها) و در سنسورها وترنسفرماتورها هم کاربرد دارند (کالوزا و همکاران[6]، 2008) چندین روش استفاده شده برای کشف ذرات نانوفلزی در نمونه های بافتی بزرگ یا بافتهای زنده بدست آمده، كه باعث رشد تشخیص و درمان بیماریها در سیستم عصبی مرکزی شده است(کوریدور و همکاران، 2009).  یکی از نانوذراتی که امروزه به میزان زیادی کاربرد دارد نانو ذره ی تیتانیوم دی اکسید است(نوروزی و همکاران، 1390). از دید سم شناسی نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید بسیار در مطالعات اكسیدهای فلزی مورد بررسی قرار گرفته است. یكی از دلایلی كه این نانوذره توجه زیادی را به خود جلب كرده تنوع استفاده از آن در صنعت است. نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید اولین نانوذره ای بود كه باعث ایجاد تحولاتی در عرصه ی صنعت و تحقیقات شد. این نانوذره معمولا به صورت معدنی و به سه فرم كریستالی با عناوین روتیل، آناتاز و بروكیت؛ و غیر كریستالی وجود دارد. نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید در پوشش دهی سطوح، لامپهای الكترونی دوقطبی، اتاقك های نوری، اسپری های ضدعفونی كننده، كالاهای ورزشی و كرم های ضد آفتاب كاربرد دارد. از پیش نیز می دانستیم كه نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید روی سیستم زیستی اثر دارد. نانوذره ی تیتانیوم با اثر بر روی سیستم ردوكس واكنشهای مختلف اكسیژنی(ROS) را در حضور اشعه ی UV راه می اندازد.(کیم و همکاران[7]، 2010).

نانوذرات در ابتدا توسط صنعتگران بین النهرین برای ساخت ظروف درخشان به کار رفت. نانوذرات در سال 1857 توسط آزمایش فارادی تحت عنوان” آزمایش ارتباط بین طلا (و دیگر عناصر) با نور”  اثبات شد. ثابت شده است که موجودات محتلف هم می توانند نانوذرات را سنتز کنند. ازجمله: گیاهان، قارچ ها و باکتریها (ویتیا و همکاران[8]، 2011). در واقع نانوتکنولوژی یک صنعت رو به پیشرفت است که تاثیر آن بر روی اقتصاد، جامعه و محیط مشهود است. مهندسین علم نانو، آن را به 4 گروه تقسیم می کنند: (1): مواد با پایه ی کربنی، معمولا شامل فلورسنس، نانوتیوب های کربنی تک دیواره(SWCNT) و نانوتیوب های کربنی چند دیواره(MWCNT). (2): مواد با پایه ی فلزی مثل نقاط کوانتومی، نانوطلا، نانوروی، نانوآلومینیوم، و نانوذرات بر پایه ی اکسیدهای فلزی مثل تیتانیوم دی اکسید ، روی اکسید و آلومینیویم اکسید. (3): دندریمرز: که پلی مرهای با مقیاس نانو هستند که از اتصال واحدهای مستعد برنامه ریزی برای انجام عملکرد های شیمیایی ساخته می شوند. و (4): ترکیبی: که ترکیب نانوذرات با دیگر نانوذرات یا مواد بزرگترهستند که مواد جدیدی می سازند. مطالعات محدودی روی اثرات مثبت و منفی نانوذرات روی گیاهان انجام گرفته است(لین و همکاران[9]، 2007). مخلوطی از نانوذره ی روی اکسید و تیتانیوم دی اکسید بر روی افزایش نیترات ردوکتاز سویا[10]انجام گرفت که در طی آن توانایی جذب و استفاده ی آب و کود، تحریک سیستم آنتی اکسیدانی و جوانه زنی و رشد افزایش داشت(لو و همکاران[11]، 2002). گزارش ها حاکی از آن بود که نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید، متابولیسم نیتروژن و فتوسنتز را افزایش داد و باعث بهبود رشد اسفناج شد(لین و همکاران، 2007).

1-2-1- انواع نانوذرات

با وجود اینکه نانوذرات و علم آن جدید می باشد و واژه های آن تنها مدتی است که در بین عموم، رواج یافته است، اما شناخت انواع آن و کاربردهای مختلف آن روز به روز بیشتر و پیشرفته تر می شود. چنانکه از انواع مختلف آن می توان به نانوذرات طلا، نقره، فلورسنس، تیتانیوم دی اکسید و… اشاره کرد. ذرات فلورسنس C60، نانوموادی کربنی و هیدروفوب با خاصیت حل شوندگی بالا در ترکیبات مختلف آلی و غیر آلی مثل، ویتامین ها، آمینواسیدها و مواد معدنی موجود در خاک هستند.

نانوذرات طلا(GNPs) دارای چندین خاصیت است که از جمله می توان به کاربرد آن در ساخت داروها و درمان بیماریها اشاره کرد. مقاومت سطحی طلا باعث شده است تا یکی از مهمترین مواد مورد استفاده در علم نانوتکنولوژی باشد. نانوکریستالهای طلا و آلیاژهای آن درون سلولهای باکتریهای لاکتیک اسید سنتز می شود. در مطالعات دیگری که انجام شده، باکتریها، اکتینومیستها، آرک ها[1] و قارچها با اتصال ذرات طلا، رسوب می کنند. مثلا PGP باسیلوس سوبتیلیس[2] و سودوموناس آئروژینوزا[3] ذرات کلوئیدی طلای درون سلولی و خارج سلولی را در حضور محلول AuCl 4- را رسوب می دهند. نانوذرات نقره(SNPs)؛ قدرت ضد باکتری بالایی حتی در غلظت های کم دارند. در مطالعات انجام شده بر روی نقره، نشان داد که حتی در بزرگترین اندازه وکمترین غلظت خاصیت مهارکنندگی رشد میکروبها را دارند. هرچند مکانیسم واقعی مهار رشد باکتریها توسط آن، هنوز مشخص نشده است(میشرا و همکاران، 2009).

2-2-1- 1نانوذره ی تیتانیوم دی اکسید[1](TiO2)

پیشرفت فناوری نانو و كاربردهای وسیع نانو ذرات در صنایع مختلف باعث شده است كه بررسی اثرات مخرب نانو مواد برروی موجودات اهمیت زیادی داشته باشد.امروزه از اكسید تیتانیوم بخاطر واكنش پذیری بالا و پایداری شیمیایی در برابر نور فرابنفش  در خالص سازی آب، گندزدایی سطوح و پاكسازی هوا، ساخت سلولهای خورشیدی و حسگرهای پایه نیمه هادی و فوتوکاتالیست ها[1] استفاده میشود و كاربرد زیادی نیز در صنایع رنگ سازی و مواد آرایشی دارد.اکسید تیتانیوم در طبیعت به سه شكل روتایل، آناتاز و بروكیت یافت میشود كه روتایل پایدارترین شكل آن است. دو فاز آناتاز و بروكیت به ترتیب در حدود دمای 915 و 750 درجه ی سانتیگراد به روتایل تبدیل میشوند. (رضایی زارچی، 1390؛ ملک فر و همکاران، 1389)

[1] Photocatalyst

[1] Titanium Dioxide Nanoparticle

[1] archaea

[2] Basilus subitilis

1-2-3- پیلور…………………………………………………………………………………………….5

1-3- سلول های موجود در غدد معده………………………………………………………………..5

1-3-1- سلول های گردن مخاط………………………………………………………………………..5

1-3-2- سلول های تمایز نیافته………………………………………………………………………..6

1-3-3- سلول های اصلی……………………………………………………………………………..6

1-3-4- سلول های کناری یا جداری ………………………………………………………………….6

1-3-5- سلول های غدد درون ریز …………………………………………………………………….7

1-4- انواع سرطان معده………………………………………………………………………………..7

1-4-1- آدنوکارسینوم نوع روده ای………………………………………………………………………7

1-4-2- آدنوکارسینوم نوع منتشر……………………………………………………………………….8

1-5- اتیولوژی سرطان معده……………………………………………………………………………..9

1-5-1 هلیکوباکتر پیلوری………………………………………………………………………………….9

1 -5-2- رژیم غذایی…………………………………………………………………………………….10

1 -5-3- سیگار…………………………………………………………………………………………….10

1-5-4- فاکتورهای ژنتیکی……………………………………………………………………………….11

1-6- مخاط معده………………………………………………………………………………………….12

1-7- موکوس معده………………………………………………………………………………………..12

1-8- پروتئین های گاستروکین …………………………………………………………………………13

1-8-1- ژن GKN1 ………………………………………………………………………………………

1-8-2-نقش GKN1 در معده و سرطان معده……………………………………………………………16

1-9- ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ژنتیکی با خطر ابتلا به سرطان……………………………………18

1-10- اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………..20

فصل دوم:پیشینه تحقیق

فصل سوم:مواد و روش ها

3-1- وسایل و مواد مورد استفاده در این مطالعه…………………………………………………….24

3-2- نوع مطالعه………………………………………………………………………………………….26

3-3- جامعه آماری و نمونه گیری……………………………………………………………………..26

3-4- رضایت نامه………………………………………………………………………………………..27

 

3-5- روش تهیه محلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مورد نیاز جهت انجام الکتروفورز………………………………………..27

3-5-1-روش تهیه بافر الکتروفورز TBE در حجم 500 میلی لیتر…………………………………….27

3-5-2- محلول رنگ آمیزی DNA Stain ………………………………………………………………

3-6- استخراج DNA از خون…………………………………………………………………………..28

3-7- تهیه ژل آگارز و الکتروفورز…………………………………………………………………………29

3-8- طراحی پرایمر……………………………………………………………………………………..30

3-9- تکثیر ناحیه پروموتری ژن GKN1………………………………………………………………..

3-10- توالی یابی……………………………………………………………………………………….35

3-11- شناسایی SNPهای پروموتر ژن GKN1 ……………………………………………………….

3-12- تکنیک  Tetra Primer ARMS- PCR…………………………………………………………..

3-13- تعیین ژنوتیپ  SNP با شناسه های rs4575760  و rs4072127 با روش Tetra- primer ARMS PCR

3-14- آنالیز آماری……………………………………………………………………………………..42

پرسشنامه………………………………………………………………………………………………43

فصل چهارم-نتایج

4-1- مشخصات جمعیت مورد مطالعه………………………………………………………………..44

4-2- بررسی ارتباط فاکتورهای خطر با سرطان معده………………………………………………47

4-2-1- عفونت هلیکوباکتر پیلوری……………………………………………………………………47

4-2-2- مصرف الکل…………………………………………………………………………………..48

4-2-3- ازدواج فامیلی والدین………………………………………………………………………..49

4-2-4- سابقه سرطان در خانواذه………………………………………………………………….51

4-3- بررسی کیفیت DNA استخراج شده…………………………………………………………..51

4-4- تکثیر ناحیه پروموتری ژن‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ GKN1……………………………………………………………..

4-5- شناساییSNP  های ناحیه پروموتری ژن GKN1…………………………………………..

4-6- تعیین ژنوتیپ  SNPبا شناسه‌های rs4575760 وrs4072127  با تکنیک Tetra Primer ARMS- PCR

4-7- بررسی ارتباط پلی مورفیسم rs 4575760  ژنGKN1  با خطر ابتلا به سرطان معده……58

4-8- بررسی ارتباط پلی مورفیسم rs 4072127 ژن GKN1 با خطر ابتلا به سرطان معده…….58

4-9- بررسی ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ژنGKN1   با نوع تومور………………………………..60

فصل پنجم-بحث و نتیجه گیری

این مطلب را هم بخوانید :

5-1- عوامل موثر در ابتلا به سرطان معده…………………………………………………………62

5-1-1- بررسی نتایج حاصل از اثر عفونت هلیکوباکتر پیلوری بر ابتلا به سرطان معده……..63

5-1-2- بررسی نتایج حاصل از تاثیر الکل با خطر ابتلا به سرطان معده………………………..63

5-1-3- سابقه سرطان در خانواده (اقوام درجه یک)……………………………………………..64

5-1-4- نتایج حاصل از بررسی ارتباط پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ تک نوکلئوتیدی پروموتر ژن GKN1 با خطر ابتلا به سرطان معده….65

پیشنهادات………………………………………………………………………………………….67

رفرنس……………………………………………………………………………………………….68

چکیده خارجی………………………………………………………………………………………78

چکیده:

مقدمه: سرطان معده شایع ترین سرطان در کشورهای آسیایی محسوب می‌‌‌‌‌‌‌‌شود و در ایران نیز به عنوان شایع ترین و اولین علت مرگ و میر به دلیل سرطان در میان مردان و دومین علت مرگ و میر در میان زنان است. یکی از عواملی که با سرطان معده ارتباط دارد، تغییر در ترکیب موکوس معده است که سطح ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌اپی‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌تلیال معده را پوشانده است. هدف: یکی از فراوان ترین پروتئین‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ موجود در موکوس معده گاستروکین 1 است که توسط ژن GKN1 در انسان کد می‌‌‌‌‌‌‌‌شود. این پروتئین در عملکرد طبیعی معده مثل تمایز طبیعی سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ اپیتلیال معده، یکپارچگی مخاط و ترمیم سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ اپیتلیال معده پس از آسیب نقش مهمی ایفا می کند. بیان ژن GKN1 در سرطان معده کاهش می یابد و از این ژن به عنوان ژن سرکوب کننده تومور در معده نام برده می شود.

مواد و روش ها: با توجه به نقش مهم گاستروکین 1 در ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌اپی‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌تلیوم معده و کاهش بیان ژن GKN1 در سرطان معده و نقش تنظیمی پروموتر در بیان ژن ها، در این مطالعه 52 بیمار مبتلا به سرطان معده و 52 فرد سالم انتخاب شده و پلی مورفیسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ تک نوکلئوتیدی قرار گرفته در ناحیه پروموتری ژن GKN1 با استفاده از توالی یابی و تکنیک Tetra-primer ARMS PCR بررسی گردید.

نتیجه گیری: نتایج نشان داد که پلی‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی rs 4575760 با خطر ابتلا به سرطان معده ارتباط دارد (032/0=P , 1=df  ,9/0-1/0 =%95CI ,42/0=OR). اما پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی rs 4072127 با خطر ابتلا به سرطان معده ارتباط ندارد ( 13/0 =P  , 1 =df , 52/4 – 8/0=%95CI  , 919/1 =OR).

فصل اول: کلیات

1-1- اپیدمیولوژی سرطان معده

سرطان معده چهارمین سرطان شایع در جهان است (1 و 2) و به عنوان اولین علت مرگ و میر به دلیل سرطان در مردان و دومین علت مرگ و میر در زنان شناخته شده است. با توجه به برآوردهای جهانی٬ سالیانه بیش از 930000 نفر به این بیماری مبتلا می‌‌‌‌‌‌‌‌شوند و حداقل 700000 نفر جان خود را از دست می‌دهند (3).

شیوع این سرطان در کشورهای مختلف تنوع گسترده‌ای دارد به طوری که کشورهای ژاپن٬ کره٬ چین٬ شیلی٬ کاستاریکا و برزیل با میزان شیوع بیش از 20 نفر به ازای هر 100 هزار نفر نواحی پرخطر٬ بیشترین شیوع سرطان معده را دارند (3). نواحی با خطر متوسط کشورهایی هستند که بین 20-10 نفر مبتلا در هر 100 هزار نفر دارند که شامل کشورهای ایتالیا٬ انگلستان٬ آلمان٬ هلند و ترکیه می‌شود (3) و در نهایت، نواحی با خطر کم کشورهایی هستند که کمتر از 10 نفر مبتلا در هر 100 هزار نفر را دارند و آمریکا٬ کانادا٬ سوئد٬ دانمارک٬ مصر٬ هند و استرالیا را شامل می‌شود (3).

بر اساس مطالعات انجام گرفته، بروز سرطان در ایران 1/49 نفر در مردان و 9/25 نفر در زنان در هر 100 هزار نفر گزارش شده است;بنابراین ایران جزء کشورهای پرخطر محسوب می‌شود (3). اگرچه شیوع جهانی سرطان معده در سال‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ اخیر به طور چشمگیری کاهش یافته است٬ اما شایع ترین سرطان در ایران به ویژه در شمال و شمال غرب ایران شناخته شده است (3 و 4).

میزان بروز این سرطان حتی در نواحی مختلف ایران نیز متفاوت است٬ در اردبیل بالاترین میزان شیوع سرطان معده را دارد و بعد از آن شهرهای سمنان، گلستان، شرق آذربایجان و تهران به ترتیب دارای بالاترین آمار ابتلا به سرطان معده در مردان و زنان در ایران هستند، در حالی که کمترین شیوع در کرمان (2/10 برای مردان و 1/5 برای زنان) گزارش شده است (3 و 4).

2-1- معده

دستگاه گوارش وظیفه هضم، جذب غذا و مواد مورد نیاز بدن و تبدیل آن به انرژی را بر عهده دارد. معده قسمتی از لوله گوارش است که بین روده کوچک و مری قرار دارد و وظیفه اصلی آن هضم غذا است. غذا پس از ورود به معده چند ساعت توقف کرده و در این مدت دچار هضم شیمیایی و فیزیکی می‌‌‌‌‌‌‌‌شود (5). معده از نظر آناتومی ‌‌‌‌‌‌‌‌به چهار قسمت تقسیم می‌‌‌‌‌‌‌‌شود: کاردیا، فوندوس یا طاق معده، تنه (بدنه) و پیلور (شکل 1-1). هر یک از این بخش ها، سلول ها و عملکرد‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مختلف دارند (6). ابتدا و انتهای معده با دو دریچه محدود شده است، دریچه‌ای که مری را به معده وصل می‌‌‌‌‌‌‌‌کند، کاردیا، و دریچه ای که معده را به روده کوچک متصل می‌‌‌‌‌‌‌‌کند، پیلور نامیده می‌‌‌‌‌‌‌‌شود (5).

1-2-1- کاردیا

کاردیا یک نوار حلقوی باریک به عرض 3-5/1 سانتی متر و در محل اتصال مری به معده است. مخاط این ناحیه دارای غدد لوله ای ساده و شاخه دار است. قسمت انتهای این غدد اغلب چین خورده است و مجرای بزرگی دارد. اکثر سلول ها در این ناحیه لیزوزوم و موکوس ترشح می‌‌‌‌‌‌‌‌کنند و تعداد کمی‌‌‌‌‌‌‌‌ نیز تولید کننده اسید می‌‌‌‌‌‌‌‌باشند (7).

2-2-1- طاق و تنه

فوندس (طاق) و تنه معده پر از غدد لوله ای معدی است که 7-3 غده لوله ای شاخه دار به داخل آن ها باز می‌‌‌‌‌‌‌‌شوند. پراکندگی سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌اپی‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌تلیال در غدد معدی یکنواخت نیست. گردن این غدد از سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌

1-2- بیماری­های روده بزرگ……………………………………….. 6

1-2-1 آپاندیسیت………………………………………………… 6

1-2-2 عفونت­های داخل شکمی………………………………… 7

1-2-3 بواسیر…………………………………………………….. 7

1-2-4 سرطان روده بزرگ……………………………………….. 7

1-3- فلورروده……………………………………………………. 8

1-4- نقش­های مهم فلور طبیعی روده……………………….. 10

1-5- تاثیر آنتی بیوتیک­ها برروی فلور روده……………………. 12

1-6- علایم خارج شدن توازن باکتری­های روده………………. 13

1-7- پروبیوتیک­ها……………………………………………….. 13

1-8- منافع مصرف پروبیوتیک­ها……………………………….. 13

1-9- اشکال پروبیوتیک­ها………………………………………. 14

1-10- پری بیوتیک­ها……………………………………………. 14

1-11- باکتری­های بی­هوازی احیاکننده سولفات………………. 15

1-12- نقش باکتری­های احیا کننده سولفات در طبیعت……..15

1-13- نقش باکتری­های احیا کننده سولفات  در صنعت نفت….16

1-14- خوردگی میکروبی…………………………………….. 16

1-15- واکنش­های احیای ترموشیمیایی سولفات…………. 17

1-16-  سیستم­های آلوده به SRB…………………………..

1-17- اهداف، فرضیات و پرسش اصلی پژوهش…………….18

1-17-1 اهداف اصلی…………………………………………. 18

1-17-2 اهداف اختصاصی……………………………………. 18

1-17-3 اهداف کاربردی………………………………………. 18

1-17-4 فرضیات پژوهش……………………………………… 18

1-17-5 پرسش اصلی پژوهش……………………………… 18

فصل دوم: پیشینه پژوهش

2-1- پژوهش­های انجام گرفته در سطح جهان……………… 20

2-2- پژوهش­های انجام گرفته در ایران………………………. 23

 

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

3-1- مواد و روش کار………………………………………….. 25

3-2- محیط کشت مورد نیاز………………………………….. 26

3-3- انتخاب بیماران مورد نظر برای نمونه ­برداری………….. 26

3-4- ارزیابی تاثیر آنتی بیوتیک ها برروی باکتری­های  SRB

3-4-1 آنتی بیوتیک کلیندامایسین………………………….. 30

3-4-2 آنتی بیوتیک جنتامایسین……………………………. 31

3-4-3 آنتی بیوتیک مترونیدازول………………………………. 31

3-5- ارزیابی خواص ضدمیکروبی آنتی بیوتیک­ها بر باکتری­های SRB مثبت…32

3-6- تعیین هویت مولکولی باکتری­های SRB مثبت………… 33

3-7- آنالیز آماری………………………………………………. 33

فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

4-1- مقدمه…………………………………………………… 35

4-2- تجزیه و تحلیل نتایج جمعیت شناختی………………. 35

4-2-1 جنسیت……………………………………………….. 36

4-2-2 سن…………………………………………………….. 37

4-2-3 میزان تحصیلات……………………………………….. 38

4-2-4 میزان درآمد……………………………………………. 39

4-3- ارزیابی فرضیات پژوهش………………………………. 40

4-3-1 فرضیه اول………………………………………………40

4-3-2 فرضیه دوم……………………………………………. 43

4-3-3 فرضیه سوم………………………………………….. 45

4-3-4 فرضیه چهارم………………………………………… 47

4-3-5 فرضیه پنجم…………………………………………. 48

4-3-6 فرضیه ششم………………………………………. 50

4-4- نتایج آزمایش  PCR…………………………………..

4-4-1 تأیید استخراج DNA…………………………………

4-4-2 تأیید PCR ژن16S rRNA……………………………

این مطلب را هم بخوانید :

4-4-3 توالی تعیین ترادف شده قطعه 16S rRNA……….

4-4-4 آنالیز فیلوژنتیکی……………………………………. 57

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1- بحث……………………………………………………..63

5-2- نتیجه گیری……………………………………………. 67

5-3- پیشنهادات……………………………………………..67

منابع و مآخذ………………………………………………… 68

فهرست منابع فارسی……………………………………… 68

فهرست منابع انگلیسی…………………………………… 70

چکیده انگلیسی…………………………………………….. 73

چکیده:

باکتری­های احیا کننده سولفات (SRB) گروه بزرگی از میکروارگانیسم­های بی­هوازی هستند که نقش بسیار مهمی در بسیاری از فرآیندهای بیوژئوشیمیایی ایفا می­کنند. این پژوهش با هدف شناسایی وتعیین هویت مولکولی باکتری­های احیا کننده سولفات و نقش آن­ها در عفونت­های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان انجام شد. روش کار: این پژوهش به صورت مقطعی-توصیفی در سال 1391 تا 1392 بر روی 50 بیمار مراجعه کننده به بیمارستان­های مختلف شهر کرمان انجام شد. تمامی افراد مورد بررسی دارای مشکلات عفونت روده بزرگ ویا آپاندیسیت بودند. در بین این افراد نمونه­گیری از حفره شکم و روده ی بزرگ انجام شد. سپس نمونه­های تهیه شده به محیط کشت اختصاصی API تلقیح و 2 ماه در دمای 35 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند. سپس نمونه­های مثبت پس از کشت مجدد در محیط جامد اختصاصیSRB ، برای خالص سازی بیشتر به محیط جدید API  منتقل گردید. شناسایی مولکولی جدایه ها با استفاده از پرایمر یونیورسال  16s rRNA و مقاومت آنتی بیوتیکی صورت گرفت. از مجموع نمونه­های مورد پژوهش از6 مورد (12%) نمونه­های مشکوک به SRB جداسازی گردید. اما با روش مولکولی در4 مورد (8%) باکتری های احیا کننده سولفات شناسایی شد. بیشترین گونه ی باکتری­های (SRB) مربوط به سویه Desulfovibrio piger بود. همچنین بین جداسازی باکتری­های SRB، سن و میزان تحصیلات افراد ارتباط معنی­داری مشاهده شد مناسب­ترین آنتی­بیوتیک برای حذف باکتری­های SRB کلیندامایسین شناسایی شد. با توجه به نقش احتمالی باکتری­های SRB در  ایجاد سرطان کلون و عفونت­های روده­ای، ضرورت انجام پژوهش­های تکمیلی و پایش مداوم بالینی در جمعیت­های گسترده تر و ارزیابی نقش بیوسایدها وآنتی­بیوتیک­ها در حذف این باکتری­ها وجود دارد.

مقدمه:

باکتری­های احیا کننده سولفات SRB به طور وسیعی در اقیانوس، آب­های شیرین، لجن­ها پراکنده­اند. این باکتری­ها از سولفات به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده و سولفید هیدروژن تولید می­نمایند. تا اکنون 14 جنس از این گروه باکتری­ها شناخته شده که به جز دسولفونما ویبرو تمامی آن­ها گرم منفی می­باشند. یک جنس از این باکتری­ها به نام دسولفوویبرو می­تواند در هنگام تکثیر فعال خود بیش از 10 گرم در لیتر سولفید هیدروژن تولید نماید (آبیارد 1382، 12-11؛ ;Geneva 2001, 157 Collette 1999, 198 ).

باکتری­های SRB نقش مهمی را در شروع التهاب یا التهاب­های دائمی از قبیل بیماری­های دندان[1] ایفا     می­کنند (;Langendijk 2000, 943-950 loubinoux et al 2003, 1304-1306 ). Desulphovibrio spp از آبسه­های شکمی و آبسه­های مغزی و همچنین از خون و ادرار نیز جدا شده­اند (Collette 1999, 198). باکتری­های SRB انرژی مورد نیاز خود را از احیای سولفات بدست می­آورند این باکتری­ها به دلیل تولیدH2s  که بجز ترکیبات سیتوتونیک[2] مهم است و یک عامل خورنده[3] می­باشد (Barton 2007, 1-523) و در مجاری دستگاه گوارش (دهان و روده) انسان و حیوانات وجود دارند. یکی از آرکی متانوژنیک (متانوژن) به نام متانو بروی باکتراسمیتی[4] در عفونت­های انسانی یافت شده است (Worden and Smelly 1996, 157-171 ) مهم ترین باکتری­های احیاکننده سولفات شناسایی شده در فلور روده عبارتند از:

دسولفوتوماکولوم[5]، دسولفوویبریو[6]، دسولفوبولبوس[7]، دسولفوفیرفیلدنیس[8]، دسولفوویبریوپیگر[9] (Goldstein 2003, 2752-2754؛ La Scola and Raoult 1999, 3076-3077 ، Susceptibilities of  23 Desulfovibrio Isolates from Humans, 5308–5311 ).

براساس مطالعات Birvin در سال 2001 در کشور کانادا شیوع مشکلات گوارشی همراه با درد 6% گزارش کرد و در سال 2003 Ehlin و در سال 2004 Wilson در انگلستان شیوع عفونت را به ترتیب 2/8 درصد و 5/10 درصد گزارش کردند که از سال 1970 تا 2004 به طرز چشمگیری افزایش پیدا کرده است. Hugin در سال 2005 و Boivin در سال 2001 در ایالات متحده امریکا عفونت روده در بین دانش آموزان و در محدوده سنی بین 16 تا 30 سال در مردان 65 درصد و در زنان 44 درصد گزارش کردند.

در سال 1992، John، Boseph و همکاران ثابت کردند که منوباکتام­ها (آزترونام) یا آمینوگلیکوزیدها به همراه کلیندامایسین یا مترونیدازول در کاهش (Intra abdominal infections) موثر می­باشند (Yoshiota et al 1991, 11-17 ).

آنتی­بیوتیک کلیندامایسین از دسته داروهای پادباکتری با نیمه عمر 2 تا 3 ساعت مانع از بیوسنتزپروتئین توسط باکتری می­شود که در درمان پریتونیت، عفونت­های داخل شکمی و همچنین عفونت­های استافیلوکوکی مصرف می­شود. مترونیدازول یکی از داروهای نیتروایمیدازول اثر کشندگی بر باکتری­های  بی­هوازی و پروتوزوآها دارد از این رو در درمان بیماری­های التهابی، کولیت پسودو ممبراند و عفونت­های ژیادریایی مصرف می­شود (منصور 1390، 36-35؛ گوهرخانی 1374، 27؛ سیمون 1368، 18-17).

هدف از این پژوهش، ارزیابی نفش باکتری­های احیا کننده سولفات در ایجاد عفونت­های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان می باشد.

1-1- مورفولوژی روده بزرگ

روده بزرگ به طول 1.4 تا 1.8 متر، از انتهای روده باریک شروع شده و به مجرای مقعد ختم می­شود. ابتدای روده­ی بزرگ که در ارتباط با ایلئوم قراردارد، سکوم یا روده کور نامیده می­شود. قسمتی ازروده بزرگ که بین سکوم وآنال کانال قراردارد، کولون نامیده می­شود که به سه قسمت کولون مساعد، کولون افقی وکولون نازل، تقسیم می­گردد. کولون نازل درانت ها به سیگموئیدورکتوم و نهایتاً آنال کانال، ختم می­شود (جان ای 1389، 90-89).

1-1-1- سکوم و آپاندیس

سکوم قسمت ابتدایی روده بزرگ است که زاییده آپاندیس به قسمت بن بست آن متصل می­شود. آپاندیس زایده­ی انگشت مانندی است به طول 10-5 سانتی­متر وقطر متوسط 8/0 سانتیمتر که با افزایش سن قطر آن کاهش می­یابد. دیواره آپاندیس مرکب از 4 لایه­ای است که درسایر قسمت­های لوله گوارش یافت می­شود. مخاط آپاندیس شبیه روده بزرگ، فاقد پرز وچین و حاوی غدد لوله­ای مستقیم است. اپیتلیوم پوشاننده آن شامل سلول­ های جذب­کننده و جامی است. آستروزیر مخاط حاوی تعداد زیادی عقده­های لنفاوی است که با افزایش سن ازتعداد آنها کاسته می­شود. در افراد سالخورده با ناپدیدشدن بافت لنفاوی درآپاندیس، مخاط وزیرمخاط فیبروزه میشوند. طبقه عضلانی در آپاندیس شبیه روده کوچک، مرکب از عضلات حلقوی درداخل وعضلات طولی درخارج است که از خارج بوسیله بافت سروز پوشیده شده است. آپاندیس یک عضو لنفاوی است و مانند دیگربافت­های لنفاوی میتواند ملتهب شده وتولید آپاندیسیت نماید (جان ای 1389، 90-89).

2-1-1- کلون

وظیفه اصلی کلون جذب آب واملاح است که در نتیجه آن مواد هضم نشده وارده از روده باریک به کلون، از حالت مایع به حالت جامد درآمده و مدفوع[1] نامیده می­شود. باتوجه به عملکرد روده بزرگ که در اصل هدایت مواد هضم نشده به خارج از بدن است، روده بزرگ فاقد چین و پرز است.

کلون شامل قسمت­های کلون صعودی، کلون عرضی، کولون نزولی، کلون خاصره لگنی یا سیگموئید روده مستقیم دنباله کلون خاصره لگنی و قسمت انتهایی روده کلفت است. طول آن 12 تا15 سانتیمتر میباشد. قسمت تحتانی روده مستقیم به مجرای مقعدی[2] ختم می­شود. رگ­های خونی تغذیه کننده روده با عبور از طبقه عضلانی به زیر مخاط رسیده و شبکه عروق بزرگی را بوجود می آورند که انشعابات آن به آستر محور پرزهای در روده باریک، نفوذ می­نماید. شریانچه­های انتهایی، پس از تشکیل شبکه مویرگی در درون پرزها به وریدچه­ها منتهی می­شوند. عروق لنفی روده به صورت بن بست از راس پرزها شروع و مجرای شیری نامیده می­شوند. این رگ­ها شبکه مخاطی را تشکیل داده وسپس به لنفاتیک­های زیر مخاط می­ریزند.     رگ­های لنفی زیرمخاطی، پس ازعبور از عقده های لنفی مسیر، توسط مجرای توراسیک به سیستم وریدی تخلیه می­شوند. بنابراین مواد حمل شده از طریق رگ­های لنفی وارد کبد نمی­شوند. عصب­گیری لوله گوارش توسط سیستم عصبی اتونوم انجام می­گیرد که خود به دو قسمت داخلی[3] و خارجی[4] تقسیم  می­گردد. قسمت داخلی که به سیستم عصبی روده­ای نیز موسوم است، مرکب از  نورون­های حسی،    نورون­های رابط و نورون­های حرکتی است که بدون ارتباط با سیستم عصبی مرکزی وبه طور رفلکس، عمل می­نماید. بدین ترتیب که تحریکات ناشی از ترکیب مواد غذایی (تحریکات شیمیایی) یا اتساع روده در اثر تجمع مواد (اتساع مکانیکی) به شبکه­های مایسنر، منتقل شده و نورون­های حرکت آنها، سبب ترشح   سلول­های اپیتلیال، انقباض عضلات وتحریک حرکات روده می­شوند (حسن پور 1389، 77-76؛ سوزان 1389، 24-23؛ ساداتی 1389، 57-56).

2-1- بیماری­های روده بزرگ

1-2-1- آپاندیسیت

بیماری آپاندیسیت یا التهاب زایده کرمی شکل شیوع فراوان دارد. علل پیدایش آپاندیسیت بسیار مختلف است. یبوست، انگل­های روده، تورم روده بزرگ، عفونت­های عمومی ازقبیل گریپ، آنژین چرکی میتوانند ایجاد آپاندیسیت نمایند. اولین علامت مهم آپاندیسیت حاد، احساس درد در اطراف ناف است، اما هنگام لمس و فشار ناحیه راست و زیرشکم، دردناک است. هنگام حمله درد آپاندیسیت، جدار سمت راست وزیرشکم سخت می شود.

بیمار حالت تهوع واستفراغ دارد. تب مختصر است و آزمایش خون ازنظر نوع گلبول­های سفید، عفونت حاد را نشان می دهد. اگر آپاندیس بیمار برداشته نشود، حمله حاد آپاندیسیت گاه به گاه تکرار خواهد شد. علت عود بیماری اغلب یک سرماخوردگی است. حملات بعدی آپاندیسیت همیشه سختتر بوده و با عوارض بیشتری توام است. آپاندیس متورم ممکن است در مدت کوتاهی چرک کند و قانقاریا شود.

2-2-1- عفونت های داخل شکمی

معمولاً توسط مخلوطی از باسیل­های روده­ای گرم منفی وباکتری­های بی­هوازی، ایجاد می­شوند. این مخلوط ارگانیسم­ها باعث ظرفیت پتانسیل بیماری­زایی باکتری­ها می­شود (دیناکی 1389، 151).

عفونت­های داخل شکمی شامل عفونت های حفره صفاق یا فضای پشت صفاقی است. حفره صفاق از زیر سطح دیافراگم تا کف لگن گسترده است و دربرگیرنده معده، روده کوچک، روده بزرگ، کبد، کیسه

1-6 سیستم زادآوری در سرده Viola……………………………………….

1-8 پراکنش جغرافیایی تیره Violaceae…………………………………….

1-9 پراکنش جغرافیایی سرده Viola………………………………………..

1-10 دورگه گیری………………………………………………………………. 17

1-10-1دورگه گیری در زیربخشه Viola………………………………………

1-11 شناسایی گونه ها در سرده Viola…………………………………..

1-12 تاریخچه مطالعات تشریحی در سرده Viola………………………..

1-13 مطالعات فیلوژنی…………………………………………………….. 24

1-13-1 مروری بر نشانگر های مورد استفاده در بررسی های فیلوژنی در سطوح زیر سرده ای Viola

1-13-2 ساختار توالی هسته ای ITS……………………………………

1-13-3 ساختار توالی کلروپلاستی trnL-F……………………………..

1-13-4 تاریخچه فیلوژنی سرده Viola…………………………………..

1- 14 اهداف……………………………………………………………….. 39

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1 مطالعات تشریحی……………………………………………………. 41

2-1-1 روش تهیه محلول های رنگ آمیزی……………………………….. 42

2-2 بررسی مورفومتری و آنالیز عددی…………………………………… 44

2-2-1 نمونه برداری………………………………………………………… 44

2-2-2 اندازه گیری و آنالیز………………………………………………….. 45

2-3 مطالعه ی فیلوژنی مولکولی در گونه های Viola…………………..

2-3-1 استخراج DNA ژنومی از گیاه با استفاده از روش CTAB………..

2-3-1-1 روش تهیه بافر CTAB……………………………………………

2- 3 – 1 -2  تعیین غلظت و خلوص DNA……………………………….

2- 4  تکثیر قطعات DNA مورد نظر……………………………………….. 52

2- 4- 1 آغازگر ها………………………………………………………….. 52

2- 4- 2 دستورالعمل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)………………… 52

2-4-3 برنامه واکنش PCR برای تکثیر قطعات  DNA مورد مطالعه……… 53

2-4-4 الكتروفورز ژل آگارز………………………………………………….. 53

 

2-4-5 تخلیص PCR………………………………………………………….

2-4-5-1 تخلیص محصول PCR……………………………………………..

2-4-5-2 تخلیص محصول PCR  از ژل……………………………………… 55

2- 4-6  تعیین توالی قطعات تکثیر یافته و آنالیز آنها……………………. 56

2-4-7 آنالیز فیلوژنتیکی……………………………………………………. 57

2-4-7-2 روش بیشینه صرفه جویی………………………………………. 58

2- 4- 7-3  روش بیشینه احتمال………………………………………….. 58

2- 4-7- 5 مقایسه دو روش آنالیزی MP  و ML…………………………..

2- 4-7- 6 نحوه ی ترکیب دو مجموعه اطلاعاتی trnL-F و ITS………..

فصل سوم: نتایج

3-1 کلید شناسایی گونه های Viola در شمال ایران…………………. 62

3-2 شرح گونه های بخشه Viola……………………………………….

3-3 مطالعات تشریحی…………………………………………………… 82

3-4 آنالیز عددی……………………………………………………………. 98

3-4-1 زیربخشه Viola……………………………………………………..

3-4-2 زیربخشه Rostratae………………………………………………

3-5 مطالعات ملکولی…………………………………………………….. 103

3-5-2 تعیین توالی قطعه تکثیر یافته…………………………………….. 105

3-5-3 آنالیز فیلوژنتیکی توالی ITS……………………………………….

3-5-3-1  آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های مولکولی nrDNA ITS……….

3-5-3-2 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های trnL-F cpDNA……..

3-5-3-3  آنالیز Maximum Liklihood داده های nrDNA ITS…………

3-5-3-4 آنالیز Maximum Liklihood داده های trnL-F cpDNA………

3-5-3-5 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

3-5-3-6 آنالیز Maximum Liklihood داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

فصل چهارم: بحث

4-1 مطالعات تاکسونومیکی…………………………………………. 124

4-2 مطالعات آناتومی…………………………………………………. 127

این مطلب را هم بخوانید :

4-3 تاکسونومی عددی……………………………………………….. 129

4-4 مطالعات ملکولی…………………………………………………. 130

4-5 پیشنهادات………………………………………………………… 134

فصل پنجم: منابع

منابع…………………………………………………………………….. 136

چکیده:

در این مطالعه، بررسی بیوسیستماتیکی بخشه Viola از سرده Viola در شمال ایران از جنبه های مرفولوژیکی، آناتومیکی و ملکولی انجام شد. آنالیز عددی برای تاکسونهای جمع آوری شده از ایران متعلق به دو زیربخشه Viola و Rostratae به صورت جداگانه انجام گرفت و بر اساس نتایج حاصل از این آنالیز، گونه های هر کدام از زیربخشه های Viola و Rostratae از یکدیگر متمایز شدند. به منظور انجام مطالعات آناتومیکی، بخش های ریشه، ساقه رونده، برگ، دمبرگ و دمگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که صفات مورد بررسی در تمایز زیربخشه ها و گونه ها  مفید هستند. بر این اساس دو گونه V. alba ssp. alba و V. sintenisii، در برشهای ریشه در وجود یا عدم وجود ناحیه مغز و تعداد لایه های پارانشیمی زیر آوند چوب از یکدیگر متمایز گردیدند. دو گونه نزدیک V. caspia و V. reichenbachiana نیز در برش های ریشه، در وجود یا عدم وجود مغز و تراکم کریستالی از یکدیگر قابل تمایز بودند. در بررسی مولکولی، از دو نشانگر، شامل nrDNA ITS و cpDNA trnL-F برای تعیین حدود گونه ها استفاده شد. بر این اساس، گونه های این بخشه به خوبی از یکدیگر متمایز شدند. به منظور بازسازی روابط فیلوژنی بخشه Viola و بررسی میزان خویشاوندی این بخشه با سایر بخشه های سرده Viola، داده های مولکولی با استفاده از روش بیشینه صرفه جویی تعبیه شده در نرم افزار PAUP* 4.b10 و روش بیشینه احتمال در نرم افزار TreeFinder (Version Of March 2011) آنالیز شدند. درخت مطلق مرکزی با بیشترین پارسیمونی برای داده های ترکیبی ITS و trnL-F، یک کلاد با ارزش حمایتی 100% را برای بخشه Viola بادو زیر بخشه Viola و  Rostratae نشان می دهد. نتایج حاصل از این مطالعه، حضور 6 گونه و 3 زیر گونه را تایید کرده است. نتایـج به دست آمده نشان داد که V. alba ssp. alba و V. sintenisii به صورت سیمپاتریک در شمال ایران پراکنش دارد.

مقدمه:

1-1- تاریخچه مطالعات سیستماتیکی سرده Viola 

سرده .Viola L. با دارا بودن 600-525 گونه همـی کریپتوفیت[1]، کامـوفیت[2] و فانـروفیت[3] بزرگتـرین سـرده خانـواده Violaceae اسـت Clausen, 1964; Ballard, 1996)). ایـن سـرده در سـال 1753 توسـط لینــه[4] معـرفی شد و نمـونه تیپ  این سـرده، V. odorata است که در سال 1982 نمونه لکتوتیپ آن توسط Haesler جمع آوری و گزارش شد (Marcussen, 1998).

این سرده در سال 1823 توسط گیاهشناس سوئیسی De Candolle به بخشه ها و زیر بخشه های مختلف طبقه بندی شد (Chatterjee & Sharma, 1987). در سده گذشته، مونوگرافر آلمانی، Becker، اولین  تاکسونومیستی بود که این سرده را در سطح جهان بررسی کرد و تعداد بسیار زیادی گونه جدیـد و تقسیم بندیهای تاکسونومیکـی جدیدی معرفی کرد (Becker, 1916, 1917a, 1917b, 1918, 1922, 1923a, 1923b, 1923c, 1923d, 1924, 1925a). مطالعات وی در ایـن زمینـه (1925b)، اولیـن ارزیابـی جامـع سرده Viola را شامـل شناسـایی 14 بخشه و تقـریباً دو برابر گروه های زیر بخشـه ای در جهـان، بوجـود آورد، بزرگتـرین بخشـه آن Nomimium بود که بعدها به نام بخشـه Viola تغییـر پیـدا کرد. سپس Clausen (1927, 1929, 1964) بازبینی های تاکسونومیکی عمده ای بر طبقه بندی Becker انجام داد که اغلب آنها توسط متخصصان بعدی پذیرفته شد، در حالیکه قسمتی هنوز مبهم باقی مانده است. متخصصان دیگر تغییرات دیگری اعمال کردند که عمدتاً شامل نامگذاری های اولیه بود (Bamford & Gershoy, 1930; Gershoy, 1934; Yuzepchuk & Klokov, 1974). Clausen گروه های بدون ساقه اصلی با عدد کروموزومی پایه x=12 یا مشتقات آنیوپلوئیدی را در بخشه Plagiostigma قرار داد و گروه های با عدد پایه کروموزومی x=10 را در بخشه Nomimium (بخشه نامعتبر Rostellatae در طبقه بندی خودش) قرار داد که اکنون به میزان زیادی کاهش پیدا کرده است. وی همچنین گروه هایی که به طور برجسته دارای ساقه اصلی و گلهای زرد بودند را از سری ها و زیربخشه ها به بخشه Chamaemelanium ارتقاء داد و بخشه Nuttallianae را به تعدادی زیر بخشه تقسیم کرد. اگرچه برخی متخصصان بخشه Dischidium در طبقه بندی Becker را حفظ کردند و زیر بخشه Orbiculares را در بخشه Nomimium ابقا کردند، Clausen بخشه Dischidium و Orbiculares را ادغام کرد و آنها را در بخشه Chamaemelanium، زیر بخشه Beflorae که به صورت نامعتبر چاپ شده بود، قرار داد. Clausen و دیگر متخصصان عقاید متفاوتی درباره محدوده و مرتبه گروه های Adnatae، Diffusae، Langsdorffianae، Stolonosae و Vaginate ابراز کرده اند (Ballard et al., 1999).

تصویری از خلاصه طبقه بندی Becker و تغییرات عمده اعمال شده توسط محققین بعدی در شکـل 1-1-1 نشان داده شده است.

2-1- موقعیت سیستماتیکی تیره Violaceae 

تیره Violaceae Batsch. با 23 جنس و نزدیک به 900-825 گونه عموماً در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان پراکنش دارد (Munzinger & Ballard, 2003; Melchior, 1925; Valentine, 1962; Watson & Dallwitz, 1992-97; Kruse, 1994). این تیره به مدت طولانی به عنوان تیره اصلی[1] راسته Violales شناخته می شد (Cronquist, 1981; Takhtajan, 1997)، ولی بر اساس مطالعات ملکولی در راسته Malpighiales قرار گرفته است (APG II, 2003; APGIII, 2009). دراین راستـه، تیـره Violaceae و 4 تیـره دیگـر (Achariaceae, Lacistemataceae, Passifloraceae & Salicaceae) یک کلاد را تشکیل می دهند (Davis et al., 2005; Tokuoka & Tobe, 2006) و Violaceae به عنوان گروه خواهری با Passifloraceae در نظر گرفته می شود (Soltis et al., 2007; Tokuoka & Tobe, 2006).

طبقه بندی تیره Violaceae توسط چندین گیاه شناس بررسی شده است (Melchior, 1925; Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). با توجه به اغلب سیستم های طبقه بندی اخیر، این تیره به 3 زیر تیره تقسیم می شود: Leonioideae و Fusispermoideae از آمریکای جنوبی، که هر دو مونوژنریک و به طور مشخص ابتدایی هستند (Hodges et al., 1995; Hekking, 1988) و Violoideae که اشتقاق بیشتری دارد و بقیه سرده را شامل می شود. این طبقه بندی بر اساس پیچش گل در غنچه[2]، میوه، نوع بذر و میزان اتصال سطح پشتی بساک ها بوده است (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). زیر تیره Violoideae بر اساس دو صفت جام گل منظم یا نامنظم و حضور یا عدم حضور شهدگاه[3] به 2 طایفه Violeae و Rinoreae تقسیم می شود (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003)، که سرده Viola متعلق به طایفه Violeae می باشد.

3-1- موقعیت سیستماتیکی سرده Viola

سرده Viola  بر اساس سیستم APG III طبق سلسله مراتب طبقه بندی زیر قرار می گیرد (APG III, 2009)

گونه های Viola در ایران بر اساس فلور ایران، در دو بخشه قرار می گیرند: بخشه Viola با 14 گونه و بخشه Melanium  با 5 گونه (خاتم ساز، 1991). این تقسیم بندی در فلورا ایرانیکا به این صورت است:

بخشه Viola با 9 گونه، بخشه Melanium با 4 گونه و بخشه Sclerosium با 2 گونه.

4-1- شرح ریخت شناسی تیره Violaceae

گیـاهانی علفی، درختچـه ای یا درختـی؛ کرک ها اغلب ساده؛ برگ ها متنـاوب یا متقابل، گاهی تشکـیل رزت انتهایی می دهند؛ ساده یا گاهی لوبدار، با حاشیه کامل یا اره ای و رگبندی شانه ای یا پنجه ای؛ دارای گوشوارک. گل آذین اغلب کاهش یافته به صورت یک گل منفرد، معمولاً محوری؛ گل ها اغلب دوجنسی؛ کاسبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، گلبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، با آرایش متراکب [1]یا حلقوی[2]، گلبرگ پایینی گاهی مهمیز دار. پرچم ها معمولاً 5 عدد، کنار یکدیگر به صورت یک حلقه به دور مادگی قرار گرفته اند، میله بسیار کوتاه، جدا از هم تا کمی پیوسته، دو بساک پشتی یا همه بساک ها با شهدگاه مهمیزی یا غده ای شکل، اغلب به یک زایده رأسی سه گوش یا غشایی متصل شده؛ دانه های گرده اغلب Tricolporate؛ برچه ها معمولاً 3 عدد، متصل؛ تخمدان فوقانی، با تمکن جانبی؛ خامه معمولاً خمیده یا نوک دار، کلاله معمولاً پهن شده، گاهی لوبدار. تخمک ها یک عدد یا بیشتر در هر تمکن؛ میوه معمولاً کپسول چند خانه ای؛ بذر ها معمولاً دارای زایده آریل.

5-1- شرح ریخت شناسی سردهViola

ریخت شناسی گل

سرده Viola بر اساس ریخت شناسی گل به دو دسته تقسیم می شود (Tutin et al., 1968): بخشه Melanium که Pansies نامیده می شوند و سایر بخشه ها که با نام عمومی Violets شناخته می شوند. وجه تمایز دو گروه نحوه قرارگیری گلبرگ های کناری است که در Violets به سمت پایین و در Pansies به سمت بالا است. ویژگی های متمایز کننده دیگر عبارتند از: (i) پراکنش بیوجغرافیایی: Pansies تنها در اروپا و غرب آسیا پراکنش دارد، درحالیکه Violets همه جا زی[1] هستند (Clausen, 1929). (ii) وجود چند شکلی[2] دانه گرده: بررسی 28 گونه اروپایی Viola نشان می دهد که 81% گونه های Pansies این چند شکلی را نشان می دهند در صورتی که این رقم برای Violets 42% است (Dajoz, 1999)؛ (iii) دیگر ویژگی های ریخت شناسی گل مانند طول جام گل و طول مهمیز؛ همچنین اکولوژی گرده افشانی در بین دو گروه به میزان زیادی متفاوت است (Beattie, 1971, 1974; Herrera, 1993; Ballard, 1996). Pansies تنها گل های برون زاد آور (Chasmogamous) تولید می کننـد (Knuth, 1908; Herrera, 1993)، در حالیکه Violets هر دو نوع گل های باز و جاذب حشرات (Chasmogamous) و گل های شدیداً کاهش یافته، بسته و خود گرده افشان (Cleistogamous) تولید می کنند (Beattie, 1969; Grime et al., 1986).

فرم رویشی: در سرده Viola، فرم رویشی به میزان قابل توجهی در بین گونه ها متفاوت است. ساختار پایه غالب در این سرده، ریزوم با برگ های رزت انتهایی (در چند ردیف)، چند ساله و ساقه گل دهنده جانبی (با برگ هایی در دو ردیف)، یک ساله است. این ساختار پایه برای مثال در V. riviniana و V. rupestris، به شکل های مختلف تغییر می یابد. در برخی گونه ها، برگ های رزت وجود نداشته و تنها ساقه گل دهنده خارج شده از ریزوم دیده می شود (V. elatior, V. canina). در برخی دیگر، ساقه هوایی به صورت ساقه رونده[3] تغییر یافته (V. palustris, V. odorata) و یا اصلاًً وجود ندارد (V. hirta, V. somchetica). در بخشه Melanium سیستم ساقه ای اصلی به میزان زیادی تغییر یافته و به آسانی قابل شناسایی نیست. گونه های درختی و درختچه ای در هاوایی دیده می شود (V. tracheliifolia, V. waialenalenae).  به گونه هایی که گل های آن در ساقه های هوایی قرار دارد، ساقه دار[4]  و به آن دسته که گل ها از محل خروج  برگ های رزت ایجاد می شوند، بدون ساقه[5] می گویند.

برگ: برگ ها ساده، رزت و یا ساقه ای با آرایش متناوب؛ معمولاً قلبی شکل، کلیوی شکل تا سه گوش، گاهی کشیده یا تخم مرغی و یا  قاشقی؛ حاشیه کامل، دندانه دار یا اره ای؛ دمبرگ دار.

کرک:  در صورت وجود ساده، با اندازه متغیر در بین گونه ها، به صورت پراکنده تا متراکم یا پشم آلود.

گوشوارک: ساده یا لوبدار تا منقسم و برگی شکل؛ حاشیه ساده، دندانه دار یا شرابه ای تا مژه دار.

گل آذین: به صورت گل منفرد دیده می شود که به صورت محوری روی ساقه گل دهنده قرار می گیرد و یا از رزت و یا ساقه رونده تشکیل می شود.

گل ها: دو جنسی؛ ریزان؛ نامنظم؛ دارای مهمیز؛ بنفش تا آبی، گاهی سفید یا زرد یا ترکیبی از اینها.

اجزاء گل:

گلبرگ: نامنظم؛ 5 عدد؛ جدا از هم؛ واژ تخم مرغی یا گرد؛ هم اندازه، بزرگتر یا کوچکتر از کاسبرگها؛ دو گلبرک کناری به سمت بالا (بخشه Melanium) و یا پایین (سایر بخشه ها)؛ گلبرگ پایینی مهمیز دار، گاهی رنگی یا مخطط (جاذب گرده افشان ها).

کاسبرگ: پایا؛ نامنظم؛ 5 عدد، جدا از هم؛ تخم مرغی، نیزه ای یا سه گوش؛ حاشیه ساده یا مژه دار.

پرچـم: 5 عدد، جدا از هم، فاقـد میـله، در رأس به زایـده غشایـی سه گوش متصـل است و به صورت حلقـه ای دور مادگـی را فرا مـی گیرد. دو بساک به همدیگر چسبیده است و هر کدام با یک شکاف باز می شود. دو پرچم پایینی زایده دار است که به درون مهمیز کشیده می شود.

1-1-  بیان مسئله………………………………………………………………………………………4

1- 2 -اهداف  پژوهش………………………………………………………………………………….5

1-3-  ضروریت انجام تحقیق……………………………………………………………………………6

1-4- تولید جنین در شرایط in vivo

1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده………………………………………………………………6

1-4-1-1- ویژگی­های اووسیت ثانویه……………………………………………………………………8

1-4-2- روند ایجاد سلول جنسی نر…………………………………………………………………..9

1-4-3- لقاح…………………………………………………………………………………………….10

1-4-4- تسهیم………………………………………………………………………………………..12

1-5- تولید جنین در شرایط in vitro

1-5-1- بلوغ آزمایشگاهی تخمک (IVM)………………………………………………………….15

1-5-2- ظرفیت پذیری اسپرم…………………………………………………………………………19

1-5-3- لقاح در شرایط آزمایشگاهی(IVF)………………………………………………………..21

1-5-4-کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی(IVC)………………………………………………..23

1-6- مقایسه جنین­های طبیعی با جنین­های آزمایشگاهی……………………………………….26

1-7- انجماد

1-7-1- مراحل اصلی انجماد…………………………………………………………………………30

1-7-2- راه­های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده…………………………………………30

1-7-3- روش­های انجماد……………………………………………………………………………….30

1-7-3-1- انجماد شیشه­ای…………………………………………………………………………..31

1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه­ای……………………………………………..32

1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری……………………………………………………………………32

1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن………………………………………………………………………32

1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن……………………………………………………………………….35

1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی……………………………………………………………………35

1-7-3-1-1-5- نقش ضد یخ­ها…………………………………………………………………………..36

1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی…………………………………………………………………………. 36

1-8- آلدوسترون………………………………………………………………………………………….37

 

1-8-1- خصوصیات………………………………………………………………………………………37

1-8-2- عملکرد………………………………………………………………………………………….38

1-9- ارزیابی کیفیت رویان……………………………………………………………………………..41

1-10- سلول­های رویانی………………………………………………………………………………..43

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1- اثرات انجماد بر روی تخمک………………………………………………………………………46

2-2- اثر روش انجماد شیشه­ای……………………………………………………………………….47

2-3- بیان زیر واحد­های پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین……………………………………..48

2-4- پمپ  Na/K ATpase ……………………………………………………………………………

2-5- آکواپورین­ها…………………………………………………………………………………………..51

2-6- هچ یا تفریخ………………………………………………………………………………………..52

2-7- فعال شدن ژنوم رویانی……………………………………………………………………………55

2-8- متابولیسم رویان…………………………………………………………………………………..56

2-9- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase………………………………………………

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)

3-1-1- جمع‌آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی……………….61

3-1-2- بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM)………………..……….…….………………………………62

3-1-3- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)…………………………………………………………………63

3-1-3-1- آماده سازی اووسیت­های بالغ شده برای لقاح………………………………………………63

3-1-3-2- آماده سازی اسپرم…………………………………………………………………………….63

3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF)………………………………………..64

3-1-5- تازه كردن محیط کشت جنین‌ها…………………………………………………………………65

3-2- تهیه محلول‌های انجمادی…………………………………………………………………………..65

3-3- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای………………………………………………………………66

3-4- محیط ذوب…………………………………………………………………………………………….66

3-5- گروه­های آزمایشی و طراحی مطالعه…………………………………………………………….66

3-6- ارزیابی جنین‌ها

این مطلب را هم بخوانید :

3-6-1- ارزیابی کیفی جنین‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی……………………………………..68

3-7- ایمونوسایتوشیمی پروتئین­های سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)……..70

فصل چهارم: نتایج

4-1- تخمک­های منجمد شده

4-1-1- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های منجمد-ذوب شده در مرحله GV

4-1-2- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم

جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های منجمد-ذوب شده…………………..82

4-1-3- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM، ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII

4-1-4- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل………………………………………………………….83

4-2- تخمک های منجمد نشده

4-2-1- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های غیر منجمد…………..85

4-2-2- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های غیر منجمد…85

4-2-3- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل………………………………………………………….86

4-3- فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث………………………………………………………………………………………………………89

نتیجه ­گیری…………………………………………………………………………………………….. 94

پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 95

منابع…………………………………………………………………………………………………….. 96

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………..113

چکیده:

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.

مواد و روش ها: تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM  و IVM). گروه های سه و چهار: IVM و IVF تخمک های منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4).  گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα1  و β1 پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.

نتایج: میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه های Vit-D4 و D4 به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Total نیز به طور معنی داری در گروه IVM بیشتر از سایر گروه ها بود.

بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.

مقدمه و معرفی طرح:

در سال­های اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوج­های بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار می­رود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روش­های کمک باروری[1](ART) تلاش­های زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمک­ها صورت گرفته است، لیکن تا­کنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمک­ها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندكی در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ­ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تكاملی تخمک ها پس از لقاح، به چشم می خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخی از نژادهای این گونه جانوری، اهمیت این گونه حیوانی از نظر اقتصادی (فراورده های دامی)، نقش آن به عنوان بیوراكتور در مطالعات مرتبط با تولید حیوان تراریخته و نیز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بین تجویز آلدوسترون و وضعیت بیان آنزیم Na+/K+/ATPase در روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسی تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد.

بدین منظور تخمك های استحصال شده از تخمدان های كشتارگاهی گوسفند، در مرحله GV از تقسیمات میوزی به روش کرایوتاپ و با استفاده از روش انجماد شیشه ای منجمد و پس از گذشت یك هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تكاملی آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می گیرد.

فصل اول: کلیات

1-1- بیان مسأله

با وجود دستیابی به کارآیی نسبتاً بالا در تکنیک های انجماد اسپرم و جنین در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنیک مؤثری به منظور انجماد تخمک های این گونه حیوانی شناسایی نگردیده است. از جمله مهم ترین اهداف انجماد تخمک در نمونه های حیوانی می توان به حفظ و مدیریت ذخایر ژنتیکی، توسعه علم مهندسی ژنتیک، ارتقای تکنیک انتقال هسته[1] (NT) در روند شبیه سازی، تهیه منابع کافی جهت انجام تحقیقات بنیادین، صادرات کم هزینه صفات ژنتیکی برتر و ایجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر این با حفظ و ذخیره سازی طولانی مدت این منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه های مدیریتی قویتر در مورد گونه های جانوری در معرض خطر انقراض و در انسان نیز امکان حفظ باروری در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهای خاص (شیمی و پرتو درمانی)، جراحی، نارسایی زودرس تخمدان و … فراهم می گردد؛ ضمن این که انجماد تخمک در نمونه های انسانی هیچ یک از مشکلات و محدودیت های اخلاقی و حقوقی انجماد جنین را نیز به همراه ندارد.  مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم می خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمك، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدید اووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید فاکتور پیش­برنده میتوز MPF[2]، کاهش مشخص متابولیت ها و پروتئین ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی اشاره نمود .

در این مطالعه به بررسی افزودن برخی عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محیط های اختصاصی کشت جنین و تأثیر آنها بر بیان پروتیین مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنینی
می پردازیم. بدیهی است نتایج حاصل از این مطالعه ضمن مشخص نمودن میزان تاثیر عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنین های حاصله از انجماد، امكان ارتقای كیفی روش های انجمادی تخمك مبتنی بر نتایج بدست آمده را نه تنها در این گونه جانوری بلكه در سایر پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدین ترتیب گامی موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک های انجمادی از مورولا به بلاستوسیست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثیر آلدوسترون در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده گوسفند بررسی نگردیده است و در صورت وجود تأثیر مثبت در این زمینه، موجب تحول روش های انجماد تخمک در گوسفند و حتی سایر گونه ها خواهد شد.

2-1- اهداف پژوهش

1- بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در طی IVM و مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .

2- ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای کیفی(جنین­های حاصله از افزایش میزان تفریخ، ICM/Total) عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

3-1- ضرورت انجام تحقیق

این پروژه با هدف پاسخ به برخی از سؤال های زیر طراحی گردید: بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسی ارتباط بین تجویز هورمون های فعال کننده تحت واحد های 1α و 1β پمپ Na+/K+/ATPase و میزان افزایش عملکرد آنزیم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسیست و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده و ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

4-1- تولید جنین در شرایط In vivo

1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده

واحدهای عملكردی تخمدان فولیكول نام دارند كه تحت سازماندهی سلولی خاص تخمک را در خود جای داده‌اند. این سازماندهی سلولی ثابت نبوده و در طی مراحل مختلف زندگی فولیكول تغییرات پیچیده‌ای می‌یابد. حاصل این تغییرات به آزاد شدن تخمک[1] و یا تحصیل فولیكول رسیده منجر خواهد شد ]132،54[.

تولید مثل با تكامل تخمك‌ها در تخمدان آغاز می‌گردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حیوان، در مرحله‌ای از سیكل جنسی حیوان ماده به نام فاز اوولاسیون[2]  از فولیكول تخمدانی به داخل حفره شكمی آزاد می‌شوند. سپس این تخمك‌ها از طریق لوله رحمی مربوطه وارد رحم می‌شوند. فولیكول‌های تخمدانی متعددی در مراحل مختلف تكاملی در استرومای كورتكس واقع شده‌اند. بیشترین فولیكول‌ها، فولیكول‌های پریموردیال[3] هستند. هر فولیكول پریموردیال حاوی یك تخمک اولیه است كه توسط یك لایه از سلول‌های فولیكولی سنگفرشی احاطه شده است. در ادامه رشد این فولیكول‌ها، سلول‌های فولیكولی تبدیل به سلول‌های مكعبی یا استوانه‌ای كوتاه می‌شوند ]148،81 [.

مجموع وقایعی كه منجر به تولید سلول زایایی تخمک در جنس ماده می‌شود، باعث بروز تمامی واكنش‌های لازم قبل، حین و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک می ‌شود که شامل یك پروسة طولانی از تمایز اووگونی در تخمدان جنینی تا بلوغ نهایی تخمک، درست قبل از اوولاسیون آن می‌باشد.

از مدت‌ها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمی از تخمک‌های اولیه حیوانات و نیز انسان می‌توانند رشد ثانویه خود را دنبال کرده، تبدیل به تخمک ثانویه شده و تخمك‌گذاری كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمین زده اند که در تخمدان‌های گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آن‌ها به مرحله تخمك‌گذاری می‌رسند] 52،136،20[.

در فرآیند بلوغ، اووسیت اولیه، پروفاز نخستین تقسیم میوزی پس از تولد را تکمیل می‌کند. در زمان بلوغ، تغییرات بعدی رخ می‌دهند. اووسیت اولیه حاوی تعدادی کرموزوم‌های دیپلوئید (xx) است. به طوری که در مرحله‌ی بلوغ، اووسیت بزرگ شده، سلول‌های فولیکولی، مکعبی و به چندین لایه تکثیر می‌یابند. همچنین یک غشای مخطط به نام زوناپلوسیدا[4]، پیرامون اووسیت تشکیل می‌شود (این لایه با به هم پیوستن زواید اووسیت اولیه و گلیکوپروتئین موجود در محل تشکیل شده است)، فولیکول بزرگ شده و فضاهای پر از مایع، بین سلول‌های فولیکولی، پدیدار شده و به هم می‌پیوندند تا آنتروم فولیکول[5] را تشکیل دهند. به همین دلیل، سلول‌های فولیکولی، تفکیک می‌شوند تا لایه‌ی گرانولوزوم[6] و کومولوس اووفوروس[7]، را تشکیل دهند. تک خارجی[8] (لایه‌ی فیبروزی) و تک داخلی[9] (لایه‌ی عروقی و