3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25

3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                              صفحه

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز…………………………. 28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR……………………………………………………………………………… 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28

4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………………….. 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس…………. 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…… 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس….. 48

4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس………………………………………………………………. 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده……………….. 56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی………………………………………………………………….. 60

4-12- نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………. 64

مقدمه و كلیات

1-1- مقدمه

از دیرباز پدیده­ی عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از این­رو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می­تواند حائز اهمیت باشد.

پیری در گیاهان به عنوان مرحله­ی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصه­های بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین­ها و لیپید­ها و سایر مولکول­های بزرگ می­باشد (نواب پور و همکاران، 2003).

در میوه­های فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه می­باشد و کنترل اتیلن از مکانیسم­های اصلی جلوگیری از پیری در این میوه­ها است. اما گیلاس یک میوه­ی نافراز­گرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر می­باشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می­تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد.

طی رسیدن میوه، دسته­ای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه­ریزی شده­اند رخ می­دهد که باعث تغییر ویژگی­های میوه‌ی نارس و تبدیل آن به میوه‌ی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه می­یابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می­کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوه­ها مساله­ای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش می­دهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئین­ها و آنزیم­هایی که بر ویژگی­های دیواره­ی سلولی

 تاثیرگذار هستند، می­توان میزان فعالیت و تاثیر آنزیم­هایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000).

نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوه­ها در هر گونه­ی خاص، ویژگی­های مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیم­های آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوه­های نافراز­گرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010).

با توجه به نافراز­گرا بودن میوه­ی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زود­رس و دیر­رس این میوه چه بخشی از ژن­های α-Man و ß-Hex و ژن توسعه­ی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاس­های زود­رس و دیر­رس می­گردد. همچنین مشخص نمی­باشد که شاخص­های پیری بین دو رقم زود­رس و دیر­رس چه تفاوتی از نظر فعالیت­های آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول، نشاسته، ساکارز سینتئاز و اینورتاز در طی دوران رسیدگی و پیری دارند. تفاوت الگوی ژنی این آنزیم­ها در سطح ژنومیک نیز مشخص نیست.

در این پژوهش، توالی­ یک ژن­ نامزد عامل پیر شدن به نام آلفامانوزیداز از پایگاه اطلاعاتی ژنوم هلو و فلفل استخراج گشت. بر اساس توالی به دست آمده و کاربرد نرم افزار پرایمر3، توالی پرایمرهای اختصاصی مناسب برای تکثیر این ژن نامزد، طراحی و سپس ساخته شد و ژن­ مربوطه از DNA ژنومیک گیلاس استخراج و به کمک دستگاه ترموسایکلر و روش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر و سپس به کمک دستگاه توالی­یاب تعیین توالی شد. در مرحله­ی بعد با کاربرد نرم­افزار پاپ ژن، توالی به­دست آمده برای ژن­ استخراج شده و ارقام زود­رس و دیر­رس مورد مقایسه قرار گرفت و اختلافات موجود از نظر حذف تک نقطه­ای و یا قطعه­ای و یا اضافه شدن ارزیابی شد. در این تحقیق اثر اسید آبسیزیک نیز بر شاخص­های پیری مورد بررسی قرار گرفت.

1-2- اهداف

این مطلب را هم بخوانید :

1. تشخیص تفاوت­های توالی ژن­ مذکور (α-Man) بین دو رقم زود­رس و دیررس و تشخیص هرگونه تفاوت در توالی هر تک نوکلئوتید یا موتاسیون تک نقطه­ای و مقایسه­ی این ژن­ها بین ارقام گیلاس زود­رس با انبارداری پایین و دیر­رس با انبارداری بالا
2. مقایسه­ی شاخص­های پیری بین این دو رقم گیلاس زود­رس و دیر­رس
3. تعیین تغییرات گلوکز، فروکتوز در زمان رسیدگی و پیری و طیف تغییرات آنها در میوه گیلاس

1-3- فرضیه­ها

1. ارقام گیلاسی که دیر­رس و دارای طول عمر انبار­داری زیادتر هستند، دارای تفاوت در توالی ژن­ مربوطه می­باشند که این احتمالا مربوط به منطقه دومین آنزیم می­باشد.
2. کاربرد هورمون اسید آبسیزیک در ارقام دیر­رس باعث بروز پیری با تاخیر بیشتری نسبت به ارقام زود­رس می­گردد.

 2- سابقه تحقیق

گیلاس[1] یکی از محصولات مهم و جذاب باغبانی در دنیا می­باشد. در کشور ما نیز این محصول به دلیل طعم و مزه مطلوب و دوره رسیدگی کوتاه میوه و تولید در اوایل فصل از اهمیت بالایی برخوردار است. با توجه به افزایش سطح زیر کشت و تولید باغ­های تجارتی و از طرفی گسترش آفات و بیماری­ها، افزایش هزینه نیروی کار در مناطق تولیدکننده جهان، قابلیت فساد سریع میوه و سیستم‌های ضعیف برای حمل و نقل که مانع توسعه چشمگیر این محصول تا 100 سال گذشته شده بود، نیاز به استفاده از فن­آوری­های پیشرفته در مراحل مختلف تولید و نگهداری این محصول بیشتر اهمیت می‌یابد. به همین علت، در تمامی مناطق تولیدکننده گیلاس اهداف مهم بهنژادی این محصول در قالب برنامه‌های کوتاه­مدت و درازمدت به جدیت پیگیری می‌شود (گنجی­مقدم و بوذری، 1388).

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس

بر اساس اطلاعات بدست آمده از حفاری­های باستان­شناسی و هسته­ها ونقوش بجامانده مشخص شده است که نیاکان قبل از تاریخ از میوه­های این درخت استفاده می­نمودند. اولین شواهد استفاده از گیلاس به عنوان یک منبع غذایی به 4000 تا 5000 سال قبل از میلاد مسیح برمی­گردد و یونانی­ها اولین کسانی بودند که به صورت اهلی به کشت و کار این میوه اقدام نمودند.

منشاء این درخت، غرب آسیا، شمال چین، افغانستان، ترکیه و ایران (اطراف دریای خزر) است. بهنژادی کنترل شده این درخت از قرن هجدهم آغاز گردید و تا قبل از آن فقط توسط گزینش تصادفی و طبیعی این عمل صورت گرفته است.

اکثر گیاهشناسان گیلاس­ها را در جنس پرونوس[2] و تیره رزاسه[3] تقسیم­بندی می­نمایند. این گیاه جزء گیاهان گلدار و نهاندانه می­باشد. اکثر آنها دیپلوئید (16= n2) بوده، اگرچه ارقام تریپلوئید و تتراپلوئید هم در آنها مشاهده شده است. این درخت جزء میوه­های هسته­دار، خزان­کننده و بزرگ قامت است. گیلاس دارای گل­های کامل، دوجنسی و گل­آذین آن به صورت دیهیم می­باشد. رنگ گل‌ها سفید و به صورت منفرد یا گروهی حداکثر پنج تا هفت تایی در روی شاخه­های یکساله و یا اسپور تشکیل می­شوند. میوه گیلاس ساده، گوشتی و شفت است که درون­بر میوه سخت و چوبی شده است و پوشش دانه غشایی و نازک است. سطح هسته صاف و میوه آن دارای یک هسته است (گنجی مقدم و بوذری، 1388).

2-2- طبقه­بندی ارقام گیلاس

بیشتر سیستم­های طبقه بندی کنونی ارقام گیلاس را بر اساس رنگ پوست، محکمی گوشت، رنگ آب میوه و زمان رسیدگی آنها طبقه­بندی می­کنند. اساس این طبقه­بندی­ها بیشتر خصوصیات و ذائقه مختلف مردم جهان می­باشد.