گرایش میکروبی

 

عنوان

بررسی ایمنی همورال کونژوگه LPS بروسلا آبورتوس S99 با Omp ماژور بروسلا آبورتوس RB51

 

استاد راهنما

دکتر حجت احمدی

 

شهریور 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                  صفحه

.1-2بروسلا وبروسلوزیس…………………………………………….10

2-1-1.تاریخچه…………………………………………………………13

2-1-2.وضعیت بیماری در ایران……………………………………..14

2-1-3.انتشار بروسلوز در جهان……………………………………………16

2-2.اهمیت مراقبت بروسلوز ) بیماری تب مالت(…………………………..17

2-3.عامل بیماری…………………………………………………………….20

2-3-1. بروسال ملی تنسیس Brucella Melitensis (دارای 3 سروتایپ)…..20

2-3-2. بروسالا آبورتوس Brucella Abortus (دارای 7 بیوتایپ)………….21

2-3-3. بروسالا سوئیس Brucella Suis (دارای 5 بیوتایپ)…………………22

2-3-4. بروسالا کنیس Brucella Canis…………………………………….22

2-3-5.  بروسالا اوویس Brucella Ovis………………………………………….22

2-3-6.  بروسالا نئوتومه Brucella neotoma……………………………23

2-3-7.  بروسالا ماریس Brucella Maris…………………………………..23

2-4. مورفولوژی………………………………………………………………..24

2-4-1. شاخص های ویرولانس………………………………………………..25

2-4-2. ژنتیک………………………………………………………………..26

2-5. راه های سرایت بیماری………………………………………………27

2-5-2. دوره نهفتگی………………………………………………………27

2-6. علائم بیماری…………………………………………………………….28

2-7-1.  تشخیص آزمایشگاهی بیماری………………………………………..29

-7-2.  انواع تست هاى سرولوژیك بروسلوز………………………………….33

2-7-2-1 تست آگلوتیناسیون داخل لوله ای استاندارد………………………………………33

2-7-2-2  تست آگلوتیناسیون ME2……………………………………………………….33

2-7-2-3. تست آنتی گلوبولین یا كمبس رایت………………………………………………34

2-7-2-4. تست فیكساسیون كمپلمان ( ثبوت مکمل )………………………………………34

2-7-2-5و6. تست های رادیوایمونواسی و ELISA…………………………………….34

2-7-2-7. تست رزبنگال………………………………………………………………….34

2-7-3. تشخیص بروسلوزیس بر اساس روش های مولکولی………….34

2-8. آنتی ژن های سطحی……………………………………………..35

2-8-1. لیپوپلی ساکارید(LPS  )…………………………………………35

2-8-2. پروتئین غشاء خارجی(OMP)………………………………….38

2-8-3. پورین های عمومی………………………………………………….41

2-9.  واکسن های بروسلوز………………………………………………42

2-9-1. واكسن های كونژوگه و طراحی آن ها……………………………………….49

2-9-1-2. انتخاب پروتئین حامل…………………………………………..50

2-9-1-1.  انتخاب پلی ساكارید…………………………………………………………..50

این مطلب را هم بخوانید :

2-9-1-3.  نسبت پلی ساکارید به پروتئین………………………………….51

2-9-1-4. تهیه ی کونژوگه های ایمونوژن هاپتن–حامل…………………….51

2-9-1-5. پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیکی..52

2-9-1-6. ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………..53

2-9-1-7. جفت شدگی شیمیایی ( اتصال) ……………………………………53

2-9-1-8. EDC یا EDAC …………………………………….54

2-9-1-9. آدپیک اسید دی هیدرازید …………………………………………55

2-9-1-10. كونژوگاسیون به شیوه آمیداسیون………………………………56

3-1. تهیه میکروارگانیسم مورد نظر……………………………………….58

3-2. باز کردن سوش لیوفریزه بروسلا آبورتوس……………………..58

3-3. کنترل سوش لیوفیلیزه از نظرRough و Smooth بودن……..59

3-4. تهیه بیوماس سلولی………………………………………………….60

3-5. استخراج و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99……………….61

3-5-1. د تو کسیفیه کردن LPS با روش قلیایی…………………………..63

3-5-2. آزمون Novotny…………………………………………………..63

3-6. استخراج و خالص سازی Omp بروسلا آبورتوس RB51……………64

3-6-2. اندازه‌گیری پروتئین با روش لوری…………………………………..65

3-7. کونژوگاسیون Omp و LPS بروسلا آبورتوس………………………..68

3-8. ستون کروماتوگرافی برای تخلیص کونژوگه………………………..69

 

3-8-1. مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافی……………………….69

3-9. آزمون کنترل کیفی کونژوگه………………………………………71

3-9-1. کنترل تب زایی در خرگوش(in vivo test)……………………71

3-9-2. کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal Toxicity)………..72

3-10. واکسیناسیون  و سنجش ایمنی زایی کونژوگه……………………..72

3-11. آزمون بررسی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان(سرم باکتریسیدال اسیSBA)……..73

3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74

4-1. تعیین میزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتنی……77

4-2. تعیین غلظت پروتئین در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوری………….80

4-3. نتایج کنترل کیفی کونژوگه……………………………………….81

4-6. نتایج بررسی کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal toxicity)..82

4-5. نتایج کنترل تب زایی در خرگوش (in vivo test)………………..82

4-7. ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم باکتریوسیدال اسی(SBA)…………..83

فهرست شکل ها

شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسط B.abortus ……………….12

شکل(2-2)بروسلا آبورتوس دارای منشاء گاوی…………………………………………..21

شکل(2-3) بروسلا سوئیس دارای منشاء خوک……………………………………………..22

شکل(2-4) بروسلا سوئیس دارای منشاء موش صحرایی………………………………….23

شکل(2-5) بروسلا سوئیس دارای منشاء پستانداران دریایی……………………………….24

شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با استفاده از اکروفلاوین………………………………..60

شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61

شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62

شکل(3-4) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69

شکل(3-5): عبور کونژوگه از ستون کروماتوگرافی………………………………..71

فهرست نمودارها و جدول ها

جدول(4-1). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت LPS استاندارد……………………78

نمودار(4-1): نمودار استاندارد غلظت LPS………………………………………………79

جدول(4-2). تغییرات جذب نوری برحسب غلظت Omp به روش لوری………………80

نمودار(4-2). نمودار استاندارد لوری……………………………………………………81

نمودار(4-3).کروماتو گرافی کونژوگه و فراکشن های آن……………………………..82

جدول(4-3): نتایج گشت رقت های مختلف سرم خرگوش تزریق شده با واکسن کونژوگه و واکسن زنده…….85

 

چکیده

بروسلوز مهمترین بیماری عفونی مشترك بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با بروسلا به وجود می آید. به خاطر ماندگاری بروسلوز،در دنیا سالیانه500000 نفر به این بیماری مبتلا می شوند.واکسن های مورد استفاده در بروسلوز همچون S19 و RB51 که به صورت زنده هستند، در مواردی منجر به بیماری در دام و یا انسان می شوند. مصونیت علیه بروسلوز نیازمند القای هردو پاسخ ایمنی، به خصوص ایمنی سلولی است بسیاری از آنتی ژنهای پیکره بروسلا به تنهایی خصوصیات کافی برای القای این پاسخ ها را ندارند. بدین لحاظ به نظر می رسد واکسن زیرواحد مؤثر علیه بروسلوز احتمالا ترکیبی از چند جزء آنتی ژنی خواهد بود.سویهRB51یک سویه واکسنی پایدار، خشن غنی از پروتئین غشای خارجی می باشد و مهمترین مزیت واکسیناسیون با این سویه، عدم القای آنتی بادی بر علیه زنجیرهO،LPSمی باشد یعنی ایمنی ایجاد شده بر علیه آن فقط از نوع سلولار می باشد.آنتی ژنهای غشای خارجی از خارجی ترین اجزای پیکره بروسلا هستند که درتماس مستقیم با سیستم ایمنی میزبان قرار دارند. بدین لحاظ به عقیده بسیاری از محققین این آنتی ژنها از اجزای اصلی واکسن های زیر واحد احتمالی خواهند بود.تزریقLPS نیز به تنهایی باعث القای تولید آنتی بادیهای مصونیت زا می گردد ولی سیستم ایمنی سلولی را تحریک نمی کند. این موضوع به دلیل نقشLPSبه عنوان یک آنتی ژن غیر وابسته به تیموس است. بدین لحاظ مصونیت ناشی ازLPSدر مقابل بروسلا، کوتاه مدت و ناقص است.بنابراین در این پروژه هدف آن است که با چسباندنLPSبهOMPواکسن کاملی تهیه گردد که بتواند هم ایمنی هومورال وهم سلولار را تحریک نماید.به این منظور بروسلا آبورتوسS99وRB51در محیط کشت بروسلا آگار کشت می گردد. سپس، سلول های کشت شده باPBSشسته شده و توده سلولی هر کدام جمع آوری می گردد.OMPاز طریق روش سدیم لوریل سارکوزینات از سویهRB51تخلیص می گردد و نیزLPS ، سویهS99از طریق روش فنل داغ اصلاح شده تهیه می گردد. سپس با استفاده از EDAC وآدیپیک اسید دی هیدرازید، لیپوپلی ساکارید بهOMP کونژوگه می گردد و پس از انجام آزمایشات کنترل کیفی، کونژوگه حاصل جهت آزمایشات ایمنی زایی به خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق می گردد و از سرم بدست آمده آزمایشاتSerum Bactericidal Assay به عمل می آید. نتایج حاصله یادداشت و برای تجزیه و تحلیل های آماری به کار گرفته می شوند.

فصل اوّل

مقدمه:

بروسلا ها کوکوباسیل های گرم منفی وغیر متحرک اند که انگل اختیاری دورن سلولی می باشند.این باکتری هاعفونت های سیستمیک و خونی در انسان وحیوان ایجاد می کنند(zoonosis).بروسلا بی هوازی اختیاری بوده که کپسول ندارد. این باکتری ها zoonosis بوده که در حیوانات اهلی به صورت منبع اصلی این باکتری ها هستند وانسان ها میزبان های اتفاقی  هستند. بروسلا ها در انسان باکتریمی داده ومی توانند برای مدت طولانی در خون انسان باقی بمانند. جنس بروسلا براساس تنوع آنتی ژنی ومیزبان اولیه شامل7گونه ی (بروسلاملیتنسیس) درگوسفندوبز،)بروسلاسوئیس (درخوك)،بروسلاآبورتوس (درگاو،) بروسلااویس (درگوسفند) بروسلاكانیس (درسگ)،،بروسلانئوتومه (درموش جنگلی و) بروسلاماریس (درپستانداران دریایی می باشد.بروسلا در میزبان حیوانی خود بیماری شدیدی ایجاد می کند اماعفونت آنها در انسان ملایم است معمولا.در بیماری بروسلوز انسانی(تب مواج یا تب مالت)دو مرحله وجود دارد یک مرحله حاد که بصورت باکتریمی حاد اتفاق افتاده وبه دنبال آن مرحله مزمن ایجاد می شود که ممکن است سال ها طول کشیده بافت های مختلفی را درگیر می کند. این باکتری ارگان های بسیاری را می تواند درگیر كند. بروسلا آبورتوس از جمله مهم ترین عوامل سقط جنین به گاو است.دلیل ایجاد سقط جنین