ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA  کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS  به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

فهرست جدول ها

فهرست شکل ها

عنوان شکل                                                                                                                   صفحه
تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010……………………………………………………………………………………….. 6
تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها  …………………………………………………………………………………………….  11
تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………  11
تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ………………………………….. 13
تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ………………………………………………………………………………………  14
تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………  16
تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس ………………………………………….  20
تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ……………………………………………………………. 21
تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه…………………………………………………………………….  24
تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس …………………………………………………………………………………  29
تصویر1-13:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………….  41
تصویر1-14:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس …………………………………………………………………………………….  41
تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………..  42
تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش REA ……………………..  46
تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم  بویس  با استفاده از روش RFLP …………………… 46
تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV ……………………….. 51
تصویر1-19 : لوکوس DR و یک توالی فاصله انداز را DVR   میگویند …………………………………………………  51
شکل 1-20 : حذف توالی های فاصله انداز، که ممکن است در یک یا چند توالی فاصله انداز باشد ………….  52
تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر …………………………………………………………………………………….  57
تصویر 3-1: نمونه­ای از عقده­های لنفاوی ………………………………………………………………………………………….  71
تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگ­آمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون……………….  75	این مطلب را هم بخوانید : سلنا گومز
تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگ­آمیزی سرد كینیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی ……………..  76
تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگ­آمیزی فلوئوروکروم …………………………………………………………………… 81
تصویر 3-5: لوله­های تست نیاسین مثبت و منفی ………………………………………………………………………………..  82
تصویر 3-6- نمائی از لوله­های کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ………………………………………………………..  83
تصویر3-7: دستگاه نانودراپ …………………………………………………………………………………………………………..  88
تصویر 3- 8:  صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ………………………………………………………………………..  88
تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر …………………………………………………………………..  89
تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ……………………….  90
تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی …………………..  92
تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینه­ای ……………………….  97
تصویر 3-13: دات بلات PGRS  و DR ……………………………………………………………………………………………………………….  102
تصویر4-1- لوله های لونشتاین– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ………………………………..  106
تصویر4-2- الكتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 …………………………………….  107
تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه ……………………………………………………………………………………  108
شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP ……………………………………………………………………………  109
تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ………………………………………..  110
تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS ………………………………………………….  111
تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ……………………………………………………….  112

چکیده:

بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا استفاده از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.