1-1-1- مقدمه……………………………………………………………. 6 1-1-2- اسامی و موقعیت تاکسونومیکی…………………………….. 7 1-1-3- خصوصیات……………………………………………………….. 7 1-1-4- بیماری­زایی R. solanacearum………………………………… الف- پلی­ساکاریدهای خارج سلولی (EPS)………………………….. 10 1-1-5- تاکسونومی R. solanacearum……………………………… 1-1-6- علائم بیماری پژمردگی باکتریایی ناشی از R. solanacearum…. الف- روی سیب ­زمینی……………………………………………….. 13 ب- روی گوجه­ فرنگی………………………………………………….. 14 ج- روی شمعدانی…………………………………………………….. 14 د- روی توتون…………………………………………………………… 14 1-1-7- چرخه بیماری و اپیدمیولوژی………………………………… 15 1-1-8- تشخیص و شناسایی باکتری R. solanacearum……….. 1-1-9- راه­های پراکنش باکتری R. solanacearum………………. 1-1-10- اهمیت اقتصادی بیماری پژمردگی باکتریایی سیب ­زمینی…17 1-1-11- میزبان­های باکتری R. solanacearum……………………. 1-1-12- مدیریت بیماری پژمردگی باکتریایی سیب­زمینی…………. 20 1-2- قارچ Colletotrichum coccodes……………………………….. 1-2-1- مقدمه………………………………………………………… 24 1-2-2- خصوصیات قارچ عامل بیماری خال سیاه سیب­زمینی………25 1-2-3- تاریخچه بیماری خال سیاه سیب‌زمینی در ایران و جهان….. 26 1-2-4- موقعیت تاکسونومیکی………………………………………. 27 1-2-5- آلودگی و توسعه علائم………………………………………. 29 1-2-6- علائم بیماری خال سیاه ………………………………………31 1-2-7- جداسازی، تشخیص و شناسایی قارچ عامل بیماری خال سیاه سیب­زمینی…..32 1-2-8- اهمیت بیماری خال سیاه سیب­زمینی………………………. 33 1-2-9- اپیدمیولوژی بیماری خال سیاه سیب­زمینی…………………. 34 1-2-10- پراکنش ودامنه میزبانی بیماری خال سیاه سیب­زمینی……35 1-2-11- تنوع قارچ C. coccodes……………………………………… 1-2-12- کنترل بیماری خال سیاه سیب­زمینی……………………… 38 الف- کنترل زراعی…………………………………………………….. 38 ب- کنترل شیمیایی………………………………………………….. 39 ج- ارقام مقاوم………………………………………………………… 40 1-3- اثر متقابل بین دو بیمارگر………………………………………. 40 1-4- بررسی­های ژنتیکی عوامل بیماری­زای گیاهی…………………. 44 1-4-1- مارکرهای مولکولی………………………………………….. 44 الف- نشانگر RAPD……………………………………………………. 1-4-2- مارکرهای بیوشیمیایی…………………………………….. 45 الف- SDS-PAGE……………………………………………………… فصل دوم: مواد و روش­ها 2-1- نمونه برداری از مزارع آلوده سیب­زمینی………………………. 47 2-2- جداسازی عوامل بیماری­زای قارچی و باکتریایی از قسمت­های آلوده….47 2-2-1- جداسازی جدایه ­های C. coccodes ………………………. 2-2-2- جداسازی استرین­های باکتری R. solanacearum………… 2-3- خالص­سازی و نگهداری………………………………………. 49 2-3-1- خالص­سازی و نگهداری جدایه­های C. coccodes………. 2-3-2- خالص­سازی و نگهداری استرین­های باکتری R. solanacearum……. 2-4- شناسایی……………………………………………………. 51 2-4-1 – شناسایی Colletotrichum coccodes…………………. الف- بررسی ویژگی­های ماکروسکوپی……………………………. 51 ب- بررسی ویژگی­های میکروسکوپی……………………………… 51 2-4-2- شناسایی Ralstonia solanacearum……………………. الف- بررسی خصوصیات فنوتیپی……………………………….. 52 2-5- تهیه محیط کشت­ها و محلول­های مورد استفاده در آزمون­های…..53 2-5-1- محیط پایه گلوکز- پپتون- آگار……………………………. 53 2-5-2- محیط Ayer’s …………………………………………… 2-5-3- محیط TTC ……………………………………………… 2-6- آزمون بیماری­زایی………………………………………….. 54 2-6-1- آزمون بیماری­زایی قارچ C. coccodes…………………. الف- روی میوه گوجه ­فرنگی……………………………………. 54 ب- روی گیاه سیب­زمینی………………………………………… 55 2-6-2- آزمون بیماری­زایی باکتری R. solanacearum………….. 2-7- تهیه مایه تلقیح…………………………………………… 55 2-7-1- تهیه اینوکولوم قارچ C. coccodes……………………….. 2-7-2- تهیه سوسپانسیون اسپور قارچ C. coccodes……….. 2-7-3- تهیه سوسپانسیون باکتری R. solanacearum……… 2-8- بررسی­های گلخانه­ ای…………………………………….. 57 2-8-1- تهیه خاک و غده سیب­زمینی………………………….. 57 2-8-2- كاشت غده­های سیب­زمینی و تلقیح عوامل بیماری­زا…..57 الف- اضافه کردن اینوکولوم قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum به خاک…..57 ب- آغشته ­سازی غده­های سیب­زمینی با قارچ C. coccodes و باکتری R. solanacearum….. 2-8-3- طرح آزمایش و آنالیز نتایج حاصل……………………… 58 2-9- استخراج DNA ژنومی قارچ C. coccodes……………….. 2-9-1- تولید میسلیوم ………………………………………….59 2-9-2 استخراج DNA به روش لی و تیلر……………………… 60 2-9-3- تعیین كمیت و كیفیت DNA……………………………… 2-10- نشانگر RAPD برای بررسی تنوع قارچ C. coccodes………….. 2-10-1- تنظیم شرایط PCR…………………………………….. الف- آغازگرهای واکنش RAPD…………………………………. ب- dNTPs……………………………………………………….. ج- كلرید منیزیم MgCl2………………………………………… د- بافر PCR (با غلظت 10 برابر) ……………………………..64 ه- آنزیم Taq DNA polymerase…………………………….. 2-11- الكتروفورز فرآورده‌های تكثیر شده…………………. 65 2-12- تجزیه و تحلیل داده‌های RAPD………………………. 2-13- استخراج پروتئین باکتری R. solanacearum………. 2-13-1- محلول­های مورد نیاز برای استخراج پروتئین­های محلول سلولی باکتری R. solanacearum……. الف- بافر Tris-Hcl 5/1 مولار با pH: 6.8…………………… دانلود پایان نامه این مطلب را هم بخوانید : کسب درآمد با تولید ویدیوی آموزشی 2-13-2- تهیه بافر استخراج……………………………….. 66 2-14- الکتروفورز پروتئین­های محلول سلولی باکتری R. solanacearum…….. 2-14-1- تهیه ژل اکریل­آمید…………………………………. 67 الف- ژل زیرین……………………………………………….. 67 ب- ژل بالایی………………………………………………… 68 2-14-2- بافر تانک…………………………………………… 68 2-15- رنگ­آمیزی ژل اکریل­آمید……………………………… 69 2-15-1- تهیه محلول رنگ­آمیزی……………………………. 69 2-16- رنگ­بری ژل اکریل­آمید ………………………………….69 2-16-1- تهیه محلول رنگ­بر …………………………………..69 2-17- نگهداری ژل …………………………………………….69 فصل سوم: نتایج و بحث 3-1- جداسازی و شناسایی………………………………… 70 3-1-1 – قارچ Colletotrichum coccodes………………….. الف- ریخت شناسی پرگنه………………………………… 70 ب- ویژگی­های میکروسکوپی………………………………… 71 3-1-2- باکتری Ralstonia solanacearum………………… الف- تست­های فنوتیپی…………………………………….. 73 ب- واکنش فوق حساسیت در توتون……………………… 74 3-2- آزمون بیماری­زایی……………………………………….. 75 3-2-1- آزمون بیماری­زایی قارچ C. coccodes………………..