پایان نامه ارشد: پاسخ های رویشی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی دو گونه بلوط زاگرس(Q.brantii و Q. libania)تحت تنش خشکی

1-2-6-3- بیوماس………………………………….. 12

1-2-7- پارامترهای فیزیولوژیک و تاثیر تنش خشکی بر روی آنها 12

1-2-7-1- محتوای نسبی آب…………………………… 13

1-2-7-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………… 14

1-2-7-3- نرخ نشت الکترولیت………………………… 14

1-2-7-4- تبادلات گازی……………………………… 15

1-2-7-5- فتوسنتز…………………………………. 16

1-2-7-6- تعرق……………………………………. 16

1-2-7-7- هدایت روزنهای……………………………. 17

1-2-7-8- عناصر غذایی……………………………… 17

1-2-7-8-1- نقش فسفر………………………………. 18

1-2-7-8-2- نقش پتاسیم…………………………….. 18

1-2-7-8-3- نقش سدیم………………………………. 19

1-2-7-8-4- نسبت سدیم به پتاسیم………………… 20

1-2-8- نشانگر مولکولی…………………………….. 20

1-2-8-1- نشانگر مولکولیAFLP……………………….. 23

1-2-9- واکنش زنجیرهای پلیمراز PCR)) ………………… 25

1-2-10- بیان ژن………………………………….. 26

1-2-10-1- مراحل مختلف بیان ژن……………………… 27

1-2-11- واکنش نسخهبرداری معکوس (RT)………………… 28

1-2-11-1- PCR همراه با نسخهبرداری معکوس (RT-PCR………. 28

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده

2-1- ویژگیهای مورفولوژیک و رویشی…………………… 30

2-2- ویژگیهای فیزیولوژیکی…………………………. 31

2-2-1- محتوای نسبی آب…………………………….. 31

2-2-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………….. 32

2-2-3- نشت الکترولیت……………………………… 34

2-2-4- فتوسنتز و هدایت روزنهای…………………….. 34

1-2-6-3- بیوماس………………………………….. 12

1-2-7- پارامترهای فیزیولوژیک و تاثیر تنش خشکی بر روی آنها 12

1-2-7-1- محتوای نسبی آب…………………………… 13

1-2-7-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………… 14

1-2-7-3- نرخ نشت الکترولیت………………………… 14

1-2-7-4- تبادلات گازی……………………………… 15

1-2-7-5- فتوسنتز…………………………………. 16

1-2-7-6- تعرق……………………………………. 16

1-2-7-7- هدایت روزنهای……………………………. 17

1-2-7-8- عناصر غذایی……………………………… 17

1-2-7-8-1- نقش فسفر………………………………. 18

1-2-7-8-2- نقش پتاسیم…………………………….. 18

1-2-7-8-3- نقش سدیم………………………………. 19

1-2-7-8-4- نسبت سدیم به پتاسیم………………… 20

1-2-8- نشانگر مولکولی…………………………….. 20

1-2-8-1- نشانگر مولکولیAFLP……………………….. 23

1-2-9- واکنش زنجیرهای پلیمراز PCR)) ………………… 25

1-2-10- بیان ژن………………………………….. 26

1-2-10-1- مراحل مختلف بیان ژن……………………… 27

1-2-11- واکنش نسخهبرداری معکوس (RT)………………… 28

1-2-11-1- PCR همراه با نسخهبرداری معکوس (RT-PCR………. 28

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده

2-1- ویژگیهای مورفولوژیک و رویشی…………………… 30

2-2- ویژگیهای فیزیولوژیکی…………………………. 31

2-2-1- محتوای نسبی آب…………………………….. 31

2-2-2- عملکرد فتوسیستم ∏………………………….. 32

2-2-3- نشت الکترولیت……………………………… 34

2-2-4- فتوسنتز و هدایت روزنهای…………………….. 34

2-3- جذب عناصر…………………………………… 35

2-4- شناسایی ژنهای مرتبط به خشکی با استفاده از cDNA- AFLP. 36

فصل سوم: مواد و روشها

3-1- نحوه جمع آوری و کاشت بذر گونههای مورد مطالعه……. 40

3-2- روش اعمال تنش کمبود آب و برداشت نهالها…………. 40

3-3- اندازه گیری پارامترهای مورفولوژیکی و رویشی……… 41

3-4- اندازهگیری پارامترهای فیزیولوژیک………………. 42

3-4-1- اندازهگیری محتوای نسبی آب…………………… 42

3-4-2- اندازه گیری عملکرد فتوسیستم ∏……………….. 42

3-4-3- اندازهگیری نرخ نشت الکترولیت………………… 42

3-4-4- اندازهگیری تبادلات گازی……………………… 44

3-4- 5- اندازهگیری سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه….. 44

3- 5- مطالعات مولکولی…………………………….. 46

3- 5- 1- استخراج RNA……………………………… 46

3- 5-2- تهیه ژل آگارز- (یک درصد)…………………… 47

3-5-3- تهیه loding day………………………………. 47

3- 5-4- تهیه MOPS [1X] (محلول تانک)………………… 48

3- 6- تجزیه و تحلیل دادهها………………………… 48

3-6-1- اندازهگیری شاخص تحمل (STI)…………………… 49

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- نتایج وبحث پارامترهای رویشی…………………… 50

4-2- نتایج و بحث پارامترهای فیزیولوژیک……………… 53

4-3- نتایج و بحث جذب عنصر…………………………. 55

4-4- نتایج و بحث شاخص تحمل………………………… 59

4-5- نتایج و بحث فتوسنتز……………………….. .. 60

4-6- نتایج و بحث همبستگی تبادلات گازی……………….. 63

4-7- نتیجهگیری کلی و پیشنهادات…………………….. 67

4-7-1- نتیجهگیری کلی……………………………… 68

4-7-2- پیشنهادات…………………………………. 69

منابع و مآخذ…………………………………….. 70

پیوست…………………………………………… 87

فهرست جدولها

جدول 1-1- مهمترین نشانگرهای dna با مزایا و محاسن آنها… 23

جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات رویشی و مورفولوژیک مورد بررسی……………………………………………….. 51

جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات رویشی و مرفولوژیک مورد بررسی در دو گونه مورد مطالعه……………………………………………….. 51

جدول4-3- مقایسه میانگین صفات رویشی و مرفولوژیک مورد بررسی در تیمارهای آبی مختلف 52

جدول4-4- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات فیزیولوژیکی مورد مطالعه 53

جدول4-5- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی در دو گونه مورد مطالعه 53

جدول4-6- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیکی در تیمارهای آبی مختلف 54

جدول4-7- نتایج تجزیه واریانس(مقایسه میانگین) جذب عنصر… 58

جدول4-8- مقایسه میانگین جذب عنصر در دو گونه مورد مطالعه. 56

جدول4-9- مقایسه میانگین جذب عنصردرتیمارهای آبی مختلف…. 56

جدول4-10- شاخص تحمل به تنش (STI) در دو گونه مورد مطالعه.. 59

جدول4-11- نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) صفات مورد مطالعه………………………………………………………………………61

جدول 4-12- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در دو گونه مورد مطالعه…………………………………………………………………..61

جدول 4-13- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در زمانهای مختلف…………………………………………………………………………62

جدول 4-14- مقایسه میانگین صفات مورد بررسی در تیمارهای آبی مختلف………………………………………………………………….62

جدول 4- 15- نتایج همبستگی پارامترهای تبادلات گازی در گونه ویول………………………………………………………………………63

جدول 4-16- نتایج همبستگی پارامترهای تبادلات گازی در گونه بلوط ایرانی……………………………………………………………….64

فهرست شکلها

شکل1-1- واکنش زنجیرهای پلیمراز…………………….. 26

شکل 1-2- رونویسی…………………………………. 27

شکل1-3- پردازش…………………………………… 27

شکل 1-4- ترجمه…………………………………… 28

شکل 1-5- نسخه برداری معکوس………………………… 29

شکل 4-1- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت پتاسم برگ…. 57

شکل4-2- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت سدیم برگ…… 57

شکل4-3- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت سدیم ریشه….. 58

شکل 4-4- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت نسبت سدیم به پتاسیم برگ 58

شکل 4-5- بر همکنش گونه و تنش خشکی برای صفت نسبت سدیم به پتاسیم ساقه 58

شکل4-6- تصویر ژل بارگذاری شده…………

چکیده

جنگلهای زاگرس حدود40 درصد از کل جنگلهای ایران را به خود اختصاص داده اند و بیشترین تأثیر را در تأمین آب، حفظ خاک، تعدیل آب و هوا و تعادل اقتصادی– اجتماعی در کل کشور دارند. این جنگلها به علت دارا بودن اقلیم مدیترانهای دارای فصل خشک طولانی در طی دورهی رویش گیاهی در طول سال بوده، و مقدار آب در دسترس در این جنگلها یک فاکتور محدود کنندهی اولیه در تجدید حیات گونههای این مناطق میباشد. تنشهای غیر زیستی مانند خشکسالی پدیدههای مهمی هستند و بر روی سلامت، بهرهوری و تناسب جنگلهای ما اثر گذار میباشند، بنابراین نیازمند به درک ژنومی و اکوفیزیولوژیکی پاسخ درختان جنگلی به تغییر شرایط آب و هوایی میباشد. با استفاده از مطالعات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و مولکولی، میتوانیم روشهای اصلاحی مختلفی که برای مقاومت به خشکی وجود دارند را شناسایی کنیم. در این آزمایش، بذور سه گونه بلوط مورد مطالعه (Q. brantii، Q.libania و Q.infectoria) در داخل گلدان پلاستیکی در فضای آزاد کاشته شدند (هرگلدان حاوی 2-1 بذر). نهالهای گونه Q.infectoria به علت سبز نشدن در این آزمایش لحاظ نگردید. جهت اعمال تنش نهالها به فضای گلخانه منتقل شدند و نهالهای سالم از هر گونه به 4 دسته تیمار کنترل و تنش کمبود آب در سه سطح تقسیم شدند. نهالهای در نظر گرفته شده برای تنش کمبود آب آبیاری نشدند تا به ظرفیت مزرعهای مورد نظر (70٪، 50٪ و 30٪ ظرفیت مزرعهای) رسیدند، ولی نهالهای کنترل هر روز آبیاری گردیدند تا محتوی آب خاک گلدانها در حدود 100٪ ظرفیت مزرعهای نگه داشته شود. پس از برداشت نهالها، پارامترهای رویشی و مورفولوژی (ارتفاع نهال، طول ریشه، وزن برگ و ساقه و ریشه، تعداد کل برگ، نسبت برگ سبز به کل برگ، بیوماس، نسبت ریشه به ساقه، وزن خشک برگ، ریشه و ساقه) و پارامترهای فیزیولوژی (محتوی نسبی آب برگ و ساقه و ریشه (RWC)، نرخ نشت الکترولیت (EL)، عملکرد فتوسیستم II و تبادلات گازی) اندازهگیری شدند و در نهایت استخراج RNA از نمونههای فریز شده برگ و ریشه انجام گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که تنش خشکی تاثیرات منفی بر پارامترهای رویشی، مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی بلوط داشت، به طوری که اکثر پارامترهای رویشی و فیزیولوژیکی کاهش یافت اما نرخ نشت الکترولیت اندامها افزایش یافت. بر اساس نتایج بدست آمده از جذب عنصر تنش خشکی باعث افزایش میزان

پتاسیم در ریشه و ساقه گردید. همچنین نتایج نشان داد که میزان شاخص تحمل نیز در گونه بلوط ایرانی در تمام پارامترهای مورد مطالعه به جز وزن تر و خشک برگ بیشتر از گونه ویول میباشد. در این مطالعه گونه بلوط ایرانی نسبت به گونه ویول با جذب سدیم کمتر برگ و در نتیجه نسبت سدیم به پتاسیم کمتر و نیز کاهش تعداد برگ توانست تحمل بهتری را از خود نشان دهد. پارامترهای مربوط به تبادلات گازی نشان داد که تیمار تنش کمبود آب سبب کاهش معنیداری در هدایت روزنهای، فتوسنتز، هدایت مزوفیلی و دیاکسیدکربن زیر روزنهای به محیطی و تعرق شد. همچنین گونه ویول فتوسنتز، کارایی مصرف آب و تعرق بیشتری نسبت به بلوط ایرانی داشت. به طور کلی میتوان نتیجهگیری کرد که در هر دو گونه محدودیت روزنهای و غیر روزنهای باعث کاهش فتوسنتز گردید. همچنین گونه بلوط ایرانی به دلیل داشتن کارایی مصرف آب کمتر و کاهش بیشتر درصد تغییرات پارامترهای گازی نسبت به گونه ویول از مکانیسم اجتناب از خشکی در زمان تنش بهره میجوید. اما در مورد مطالعات مولکولی عمل استخراج RNA صورت گرفت مرحله run کردن نمونه نیز انجام شد ولی در مرحله الکتروفورز به علت مشاهده نشدن نوارهای مربوط بهRNA مطالعات مولکولی موفقیتآمیز نبود.

1-1- مقدمه و هدف

جنگلهای زاگرس از گستردهترین اکوسیستمهای جنگلی در حال تخریب در ایران میباشند و دومین اكوسیستم طبیعی بعد از جنگلهای شمال محسوب میشوند که از لحاظ حفاظت آب و خاک و مسائل اقتصادی، اجتماعی اهمیت بالایی دارد (حسینی و همکاران، 1387). بنابراین احیاء و غنیسازی این جنگلها با گونههای مختلف جنس بلوط که مهمترین جنس تشکیل دهندهی آن است، ضروری میباشد (ذوالفقاری، 1387). اما جنگلهای زاگرس به دلیل داشتن اقلیم مدیترانهای، دارای فصل خشک طولانی در طی دورهی رویش گیاهی و پراکنش نامنظم بارندگی در طول سال هستند و در نتیجه مقدار آب در دسترس این جنگلها به عنوان یک فاکتور محدود کننده اولیه در تجدید حیات گونهها به ویژه بلوط محسوب میشود. طبق نظر محققین جنگلهای بلوط غرب در زمره جنگلهای خشکیگرا هستند. سه گونهی بلوط در کل زاگرس وجود دارد که هر 3 گونه بومی ایران میباشند و مورد قبول اکثر گیاه شناسان ایران است. این گونه ها شاملQuercus infectoria و Quercus libania و Quercus brantii میباشند (جزیرهای و ابراهیمی، 1382).

بر اساس مناطق رویشی، رویشگاه گونههای مختلف زاگرس را به دو بخش متمایز تحت عنوان زاگرس شمالی و زاگرس جنوبی تقسیم نمودهاند. زاگرس شمالی رویشگاه ویژهQuercus libani Olivier است كه البته در قسمتهایی از این حوزه با Q. infectoria Olivier یاLindl Q. brantii یا با هر دو مخلوط میگردد. اما زاگرس جنوبی که دارای اقلیم خشکتری نسبت به زاگرس شمالی است، رویشگاه ویژه گونه Q. brantii است (جزیرهای و ابراهیمی، 1382).

تنشهای غیر زیستی مانند خشکسالی پدیدههای مهمی هستند و بر روی سلامت، بهرهوری و تناسب جنگلهای ما اثر گذار میباشند، بنابراین نیازمند به درک ژنومی و اکوفیزیولوژیکی پاسخ درختان جنگلی به تغییر شرایط آب و هوایی میباشد (راجورا و همکاران[1]، 2011). کمبود آب، یک مشکل جهانی رو به افزایش است. کمبود آب تولید بسیاری از اکوسیستمهای طبیعی را مخصوصاً در اقلیمهای خشک محدود میکند. به علاوه تنش آبی به عنوان مهمترین تنش غیرزیستی نقش مهمی در کاهش تنوع ژنتیکی و عملکرد گیاهان در جهان دارد (كوچكی و همكاران،1384). هر چند جنگلهای غرب ایران از نظر وسعت